miR-145-5p通過靶向ABCE1表達(dá)影響人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖和遷移

于 潛，韓 旭，李曉倩，楊雪英*

0 引言

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，而非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%，具有致病因素及臨床癥狀多樣等特點[1]。肺腺癌是NSCLC重要的病理類型之一，其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要因素。雖然目前以手術(shù)切除為主、放化療以及生物靶向治療為輔的綜合治療能夠在一定程度上減輕患者痛苦，但肺癌的死亡率仍逐年增加[2]。肺癌轉(zhuǎn)移是多基因參與的綜合過程，涉及到多種腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)和(或)功能異常[3-4]。因此，篩查和識別腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、探尋基因治療、為臨床提供新的診療靶點尤為重要。

微小RNA(microRNA，miR)屬于非編碼RNA家族中的一員，基因序列高度保守，廣泛存在于哺乳類動物中，通過與靶基因的3′非編碼區(qū)(3′Untranslated Regions,3′UTR)互補(bǔ)結(jié)合，抑制靶基因翻譯或降解，從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控功能，在細(xì)胞生長、分化、增殖過程中起關(guān)鍵作用，也是有待研發(fā)的肺癌基因治療的重要工具[5-6]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-145-5p通過負(fù)性調(diào)控其靶基因表達(dá)參與多種腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[7-9]，但其在NSCLC中的作用尚無報道。

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白E1(ABCE1)屬于ABC超家族的一員，能夠重新啟動翻譯，調(diào)控真核生物的蛋白合成，參與病毒衣殼的裝配過程，并在機(jī)體組織防御過程中發(fā)揮重要作用，與某些惡性腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[10-12]。前期研究顯示，肺腺癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中，ABCE1表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常肺組織，并通過Fe-S簇結(jié)構(gòu)域調(diào)控細(xì)胞骨架，促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移[13-14]。

因此，本研究觀察miR-145-5p在肺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，通過改變miR-145-5p的表達(dá)水平，探討其與ABCE1可能存在的內(nèi)在聯(lián)系以及在A549細(xì)胞侵襲及遷移中的作用和機(jī)制。

1 實驗方法

1.1 臨床資料收集 選取2018年1-6月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院行手術(shù)治療的20例肺腺癌患者，男10例，女10例，年齡40～72歲，平均(62.9±5.58)歲。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療。術(shù)中切除原發(fā)灶作為實驗樣本，同時切除距原發(fā)灶10 cm以上、且經(jīng)病理醫(yī)生證實無癌組織侵犯的肺組織作為對照的癌旁組織。

1.2 A549細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。A549細(xì)胞培養(yǎng)條件：10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后，經(jīng)PBS緩沖洗滌后，室溫下在100 μl DNA-氯化鈣-2-(二乙醇氨基)乙磺酸-緩沖鹽的混合物中靜置20 min。使用磷酸鈣法細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒(碧云天)將miR-145-5p的模擬物、抑制劑和陰性對照物分別轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中孵育48 h。

1.3 miR-145-5p靶基因預(yù)測和驗證 生物信息學(xué)軟件TargetScan Human(http://www.targetscan.o rg/)列出能與ABCE1結(jié)合的所有miRs，根據(jù)互補(bǔ)堿基對長度、是否保守等因素初步確定為miR-145-5p。分別構(gòu)建帶有野生型和突變型結(jié)合位點的熒光報告基因載體，通過測序確認(rèn)克隆載體成功構(gòu)建。將各組細(xì)胞接種于24孔板中，熒光報告載體與miR-145表達(dá)質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒均轉(zhuǎn)染入A549 細(xì)胞株。48 h后按照試劑盒說明檢測A549細(xì)胞中螢火蟲和海腎熒光素酶的活性，結(jié)果以螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性比值表示。

1.4 MTT實驗 將各組細(xì)胞均以1×103個/孔的密度接種于96 孔板，接種細(xì)胞后2、12、24、36、48 h觀察細(xì)胞狀態(tài)，貼壁且生長狀態(tài)良好者繼續(xù)每孔加入180 μl 10% F12K培養(yǎng)基與20 μl 5 mg/ml MTT的混合培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后酶標(biāo)儀OD 570 nm讀數(shù)。以時間為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.5 劃痕愈合實驗 采用對數(shù)生長期、融合度超過90%的細(xì)胞，使用滅菌后Axygen 200 μl移液器吸頭垂直在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上劃線。PBS緩沖液徹底清洗劃線后的脫落細(xì)胞并拍照。劃痕后48 h觀察細(xì)胞，并再次對劃痕處進(jìn)行拍照對比。

1.6 熒光定量PCR 使用TaqMan微小RNA試劑盒提取并通過qRT-PCR測定miR-145含量。Trizol提取各實驗組中A549細(xì)胞的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR的反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(30個循環(huán))。溶解曲線參照儀器自動程序。使用U6和GAPDH作為內(nèi)參，相對表達(dá)量以2-△△C法計算。引物序列為：miR-145-5p，上游：5′-ATC GTCCAGTTTTCCCAGG-3′，下游：5′-CGCCTCCACACACTCACC-3′;U6，上游：5′-ATTGGAACGATACAG AGAAGATT-3′，下游：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；ABCE1，上游：5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCAGACAAGTTAACGAG-3′,下游：5′-TCCTTGTAGTCCATACCATCATCCAAGAAAAAGTAGTTTC-3′；GAPDH，上游：5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′；下游：5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。

2 實驗結(jié)果

2.1 miR-145-5p在肺癌組織和人肺腺癌A549細(xì)胞系中的表達(dá)變化 與癌旁組織相比，miR-145-5p在人非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見圖1A；與293T工具細(xì)胞相比，miR-145-5p在人肺腺癌A549細(xì)胞系表達(dá)量亦顯著降低(P<0.05)，見圖1B。

2.2 ABCE1 miR-145-5p的靶基因 TargetScan生信預(yù)測軟件提示，ABCE1可能為miR-145-5p的靶基因，在3′UTR存在互補(bǔ)結(jié)合的堿基對(圖2A)。報告基因?qū)嶒烇@示，在轉(zhuǎn)染miR-145-3p表達(dá)質(zhì)粒的A549細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染野生型ABCE1-3′ UTR載體能夠顯著降低熒光素酶活性(P<0.05),見圖2B；而共轉(zhuǎn)染突變型ABCE1-3′UTR載體未見熒光素酶活性明顯變化(P>0.05)。在轉(zhuǎn)染miR-145-5p陰性表達(dá)對照質(zhì)粒的A549細(xì)胞中熒光素酶活性均未見明顯改變(P>0.05)。

2.3 miR-145-5p表達(dá)的變化對A549細(xì)胞中ABCE1 mRNA表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染48 h后，PCR檢測結(jié)果顯示，在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-145-5p模擬物可顯著增加miR-145-5p的表達(dá)，降低ABCE1 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，見圖3A；轉(zhuǎn)染miR-145-5p抑制物可顯著抑制miR-145-5p的表達(dá)，增加ABCE1 mRNA的表達(dá)(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-145-5p陰性對照物沒有明顯變化(P>0.05)。

2.4 miR-145-5p表達(dá)的變化對A549細(xì)胞增殖能力的影響 MTT實驗結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-145-5p模擬物組在OD 570 nm時測定的吸光度數(shù)值明顯小于未轉(zhuǎn)染組、抑制物組和對照組，提示增殖能力降低(P<0.05)，見圖3B；抑制物組的吸光度明顯高于另外3組，提示增殖能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染陰性對照物組與未轉(zhuǎn)染組的吸光度數(shù)值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 miR-145-5p表達(dá)的變化對A549細(xì)胞遷移能力的影響 細(xì)胞劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-145-5p模擬物組的劃痕清晰，距離未見明顯縮短(P<0.05)，見圖3C；轉(zhuǎn)染抑制物組的劃痕距離明顯縮短，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染陰性對照物組的劃痕距離雖有改變，但遷移能力仍弱于抑制物組細(xì)胞(P>0.05)。

圖1 miR-145-5p在肺癌組織和人肺腺癌A549細(xì)胞系中的表達(dá)

圖2 miR-145-5p的靶基因預(yù)測和熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C

注：A.Target ScanHuman生信數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-145-5p和ABCE1存在的結(jié)合部位，B.熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實ABCE1是miR-145-5p的靶基因。與共轉(zhuǎn)染miR-145-5p表達(dá)質(zhì)粒和野生型ABCE1-3′UTR載體的A549細(xì)胞比較，**P<0.05

圖3 miR-145-5p表達(dá)變化對A549細(xì)胞中ABCE1表達(dá)、增殖和遷移能力的影響

注：A.PCR檢測轉(zhuǎn)染48 h后A549細(xì)胞中ABCE1 mRNA表達(dá)變化，B.MTT檢測轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞增殖能力變化，C.劃痕愈合實驗檢測轉(zhuǎn)染48 h后A549細(xì)胞遷移能力變化。與miR-145-3p過表達(dá)質(zhì)粒ABCE1-3′UTR載體的A549細(xì)胞比較，**P<0.05

3 討論

miRs是一類長度約為18～22個核苷酸的非編碼RNAs。近年來，越來越多的研究證實，miRs表達(dá)水平和差異可作為癌癥診斷、治療和評估預(yù)后的重要指標(biāo)[15-16]。在甲狀腺癌中，miR-145可由甲狀腺癌細(xì)胞分泌，通過調(diào)控靶基因AKT3的表達(dá)，進(jìn)一步影響PI3K/Akt通路的活化，是促進(jìn)甲狀腺癌生長的主要調(diào)節(jié)因素[17]。在胰腺導(dǎo)管腺癌中，外源性增加miR-145-5p的表達(dá)，可以通過降低靶基因Smad3的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲[18]。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌中，癌組織和A549細(xì)胞系中miR-145-5p的表達(dá)均明顯下降，提示miR-145-5p與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

通常，miR通過與靶基因3′UTR互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮調(diào)控分化、免疫和腫瘤發(fā)展等多種生物學(xué)作用[16]。同樣，本研究通過TargetScan Human數(shù)據(jù)庫預(yù)測，在ABCE1 3′UTR的1118至1125位置存在7個連續(xù)與miR-145-5p互補(bǔ)的核苷酸，結(jié)合穩(wěn)定性高，可能存在調(diào)控關(guān)系。進(jìn)一步采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，發(fā)現(xiàn)在共轉(zhuǎn)染miR-145-5p表達(dá)質(zhì)粒和野生型ABCE1 3′UTR載體的A549細(xì)胞中熒光素酶活性顯著降低，而突變型載體沒有明顯變化，證實ABCE1是miR-145-5p的靶基因。此外，轉(zhuǎn)染人工合成的miRs產(chǎn)物從外源性改變miR-145-5p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-145-5p的模擬物能夠明顯降低ABCE1的表達(dá)，而miR-145-5p抑制劑能明顯增加ABCE1的表達(dá)，兩者呈負(fù)相關(guān)，與熒光素酶報告基因結(jié)果一致。

轉(zhuǎn)染不同miRs產(chǎn)物對A549細(xì)胞的增殖和遷移能力有影響，與既往研究結(jié)果一致[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染陰性對照物的細(xì)胞相比，miR-145-5p的模擬物能夠明顯降低A549細(xì)胞中ABCE1 mRNA的表達(dá)，同時降低在OD 570 nm時測定的吸光度數(shù)值，縮短劃痕后的愈合遷移距離，表明A549細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯下降；而轉(zhuǎn)染miR-145-5p抑制物組的A549細(xì)胞增殖和遷移能力明顯增強(qiáng)。

綜上所述，ABCE1是miR-145-5p的靶基因，外源性改變miR-145-5p的表達(dá)能夠通過負(fù)性調(diào)控ABCE1的變化，進(jìn)一步改變?nèi)朔蜗侔┘?xì)胞A549的增殖和遷移能力。本研究揭示了肺腺癌轉(zhuǎn)移的新的機(jī)制，為臨床綜合治療提供了新的作用靶點。