穩(wěn)定表達(dá)Tax基因HTLV-1細(xì)胞系的建立

夏 云

(鄭州市衛(wèi)生學(xué)校，鄭州450000)

成人T 細(xì)胞白血病(adult T-cell leukemia，ATL)是嚴(yán)重危害人類健康的一種疾病，是由人類T細(xì)胞白血病I 型病毒(human T-cell leukemia vires type-1，HTLV-1)感染所致的一種特殊類型白血病，均見于成人起?。?］。盡管目前采用多種治療方法，但對于急性或淋巴瘤型ATL 的預(yù)后還是很差。該研究應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將含有neo 基因的PCMV -Tax 載體質(zhì)粒和PCMV 空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染T 淋巴瘤Jurkat 細(xì)胞系，利用G418 的藥物選擇特性對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行壓力篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞，并對其進(jìn)行鑒定。模擬成人T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞，從而為進(jìn)行下一步的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。也為臨床揭示腫瘤進(jìn)展提供重要的標(biāo)志，有利于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和治療［2］。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要試劑 TRNzol -總RNA 提取試劑(北京天為時代科技有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司);聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒(北京天為時代科技有限公司);G418 (美國 sigma 公司);liporectamin2000(脂質(zhì)體)美國Invitrogen 公司;JurkatE6-1 細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室提供;TfxTM-50Reagent 轉(zhuǎn)染試劑盒(Promega 公司)。

1.2 引物

β-actin:

上游引物序列為:5’- TGA CGG GGT CAC CCA CAC TGT GCC CAT CTA -3’，下游引物序列為:5’- CTA GAA GCA TTG CGG ACG ATG GAG GG -3’，擴(kuò)增片段長度為:660bP。

Neo:

上游引物序列為:5’-TCT GAT GCC GCC GTG TT-3’，下游引物序列為:5’-GAT GTT TCG CTT GGT GGT-3’，擴(kuò)增片段長度為:324 bp。

Tax:

上游引物序列為:5’- CAGGGTTTGGACAGAGTCTT-3’，下游引物序列為5’-GATAAGGAACTGTAGAGCTG - 3’，擴(kuò)增片段長度為:202 bp。

以上引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞的準(zhǔn)備 Jurkat 細(xì)胞接種于10%滅活小牛血清的新鮮1 640 培養(yǎng)液中，內(nèi)含100 U/ ml 青霉素、100 U / ml 鏈霉素，37 ℃飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 ～3 d 傳代1 次，調(diào)整細(xì)胞密度不超過5 ×105/ml。

2.2 G418 對Jurkat 細(xì)胞最小致死量測定 將細(xì)胞傳至25 ml 培養(yǎng)瓶中每瓶加3 ml 細(xì)胞生長液，按下列濃度加G418:100，200，300，400，500，600，700，800，900，1 000 μg/ml 繼續(xù)培養(yǎng)觀察細(xì)胞生長及死亡情況每天換液一次仍以上述濃度加G418 兩周內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最小濃度即為最小致死量［3］。

2.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(使用試劑盒LipofectamineTM2 000轉(zhuǎn)染)

方法:Jurkat 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染PCMV-Tax 載體和PCMV 空載體兩組質(zhì)粒。

(1)轉(zhuǎn)染當(dāng)天每孔(24 孔板)加入1 ml 無抗生素的培養(yǎng)基含5 ×105個細(xì)胞;

(2)對每種轉(zhuǎn)染樣本準(zhǔn)備以下DNA -脂質(zhì)體混合物:

①用50 μl 無血清培養(yǎng)基稀釋3 μg DNA，輕輕混勻;

②在使用前臨時將所需的10 μl 脂質(zhì)體用50 μl 無血清培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫孵育5min;

③孵育5 min 后，將稀釋的DNA 和稀釋的脂質(zhì)體輕輕混合，室溫孵育20 min 以利于DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物形成。

(3)將DNA -脂質(zhì)體復(fù)合物加入到含細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，震蕩培養(yǎng)板輕輕混合。

(4)轉(zhuǎn)染24 h 后將細(xì)胞以1∶10 的稀釋比例傳到新鮮的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入篩選劑G418(600 μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)。21 d 后未轉(zhuǎn)染細(xì)胞基本全部死亡，用含G418 (300 μg/ml)的1 640 培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行維持篩選，即為G418 抗性Jurkat 細(xì)胞。

2.4 細(xì)胞基因DNA 的制備:酚/氯仿抽提的方法制備細(xì)胞的DNA(略)。

2.5 抗性細(xì)胞PCR 鑒定

①反應(yīng)體系

10 ×PCR Buffer 2.5 μl DMSO 1.5 μl 2.5 mM dNTPs 2.5 μl Neo primer F 1.0 μl Neo primer R 1.0 μl DNA template 1.0 μl Taq 酶 0.5 μl ddH2O 15.0 μl 25.0 μl

②反應(yīng)條件

溫度 時間 循環(huán)96 ℃ 5 min 1 94 ℃ 50sec 30 55 ℃ 50sec 72 ℃ 50sec 72 ℃ 5 min 1

用1. 0% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 G418 對Jurkat 細(xì)胞的最小致死量測定結(jié)果經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)濃度確定為600 μg/ml，700，800 μg/ml的G418 均可將Jurkat 細(xì)胞殺死而濃度為400，500 μg/ml 的G418 雖可殺死部分細(xì)胞但仍有存活的細(xì)胞。故確定600 μg/ml 的G418 為Jurkat 細(xì)胞的最小致死量濃度，300 μg/ml 的G418 為Jurkat 細(xì)胞的維持濃度。

3.2 檢測TaxP 和TaxN 細(xì)胞基因組DNA( 見圖1)

圖1 TaxP 和TaxN 細(xì)胞基因組DNA 的提取

3.3 PCR 檢測neo 基因的轉(zhuǎn)染 用600 μg/ml 濃度的G418 對轉(zhuǎn)染的Jurkat 細(xì)胞進(jìn)行篩選3 周后，用含G418(300 μg/ml)的1 640 培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行維持篩選1 周，PCR 檢測neo 基因在其中整合的結(jié)果。用所設(shè)計的特異引物Neo 對TaxP，TaxN 和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示:TaxP，TaxN 均能擴(kuò)增出約324bp 的特異片段，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒有擴(kuò)增出特異片段(見圖2)，說明轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)載體已整合到基因組中。

圖2 PCR 檢測neo 基因的轉(zhuǎn)染A Marker3000 B TaxP 細(xì)胞組C TaxN 細(xì)胞組D 未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組

3.4 檢測所提取的總RNA 提取的RNA 產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳觀察、檢測可見28S 與18S亞基rRNA 的兩條清晰帶，提示RNA 純度較高，完整性好(見圖3)。

圖3 總RNA 瓊脂糖電泳掃描圖

3.5 RT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Tax 基因的表達(dá)見圖4。

圖4 RT-PCR 檢測Tax 基因mRNA 表達(dá)

4 結(jié)果討論

HTLV-1 感染CD4+T 細(xì)胞而導(dǎo)致T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，起主要作用的是H TLV-1 的TAX 蛋白。TAX 蛋白本身并無DNA 結(jié)合能力，它通過與宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的直接或間接作用激活病毒和宿主細(xì)胞基因。通過與這些轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，TAX 不僅可激活病毒自身的長末端重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄，也可激活一些即早期血清反應(yīng)基因、細(xì)胞因子基因和其受體基因。這些細(xì)胞基因的激活導(dǎo)致T 細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化，并與其它因素一起參與ATL 的發(fā)生。為了更好地研究HTLV-1 病毒TAX 蛋白對T 細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的影響及在ATL 發(fā)病中的作用，筆者將Tax 基因真核表達(dá)載體PCMV-tax 及空載體PCMV-neo 用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)入JurkatE6-1 細(xì)胞，并經(jīng)G418 篩選和RTPCR 擴(kuò)增Tax 基因鑒定。經(jīng)過以上實(shí)驗(yàn)，證明獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PCMV-Neo-Tax 基因的細(xì)胞株和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體PCMV-Neo-Bam 的Jurkat 細(xì)胞株，為以后的實(shí)驗(yàn)研究提供了良好的細(xì)胞模型，為進(jìn)行下一步的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］Tomita M. Inhibition of heat shock protein-90 modulates multiple functions required for survival of human T - cell leukemia virus type I-infected T-cell lines and adult T -cell leukemia cells［J］.Oncogene，2007，406(2):317 -323.

［2］Yoshida M. Discovery of HTLV-1，the first human retrovirus，its unique regulatory mechanisms，and insights into pathogenesis［J］.Oncogene，2004，24:5 931 -5 937.

［3］Richardson PS，Cooke K，Gerrish P，et al. Natural killer and lymphokine activated cytotoxicity following anaesthesia in patients with uveal malignant melanoma［J］. Melanoma Res，2010，7(2):129 -137.