聲脈沖輻射力彈性成像評估肝纖維化程度的動物實驗研究

童瑾，曹春莉，馬婷，劉閃閃，康燕飛，徐麗紅，杜婷婷，李軍

慢性肝臟疾病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病，在世界范圍內(nèi)有較高的病死率和發(fā)病率［1］。慢性肝臟疾病可引起持續(xù)、反復(fù)的肝實質(zhì)炎性反應(yīng)及壞死，使肝臟內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)過度沉積而降解不足進而形成肝纖維化。作為各種慢性肝臟疾病向肝硬化轉(zhuǎn)變的必經(jīng)階段，肝纖維化在反映病情嚴(yán)重程度和預(yù)后情況方面具有重要意義［2］。研究發(fā)現(xiàn)早期治療可以延緩肝纖維化的進展速度［3］。另有研究報道肝纖維化病理分期中F1、F2期的治療效果較好，病情可以完全逆轉(zhuǎn)，F(xiàn)3、F4期的治療效果較差［4］。目前肝纖維化程度的診斷方法主要有肝穿刺活檢術(shù)、血清學(xué)標(biāo)志物等，但各診斷方法又各有其缺陷，肝穿刺活檢術(shù)因其有侵入性、存在取樣誤差等而難以廣泛開展［5-6］。血清學(xué)標(biāo)志物檢測操作簡便、過程具有可重復(fù)性、結(jié)果客觀，但目前尚未發(fā)現(xiàn)單一血清學(xué)標(biāo)志物能準(zhǔn)確評估肝纖維化程度。因此非侵入性、簡單易行、診斷效能高的肝纖維化評估方法成為近年的研究熱點。

聲脈沖輻射力彈性成像（ARFI）作為一種新的彈性成像技術(shù)，因其能無創(chuàng)而有效地評估組織彈性，在臨床上得到廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)飛速發(fā)展成為醫(yī)學(xué)超聲影像技術(shù)研究的前沿和熱點［7-10］，其通過測量感興趣區(qū)（ROI）的剪切波速度（SWV）來評估組織彈性，即組織的硬度或質(zhì)地，已廣泛應(yīng)用于腹部及淺表器官疾病的定性診斷。有研究發(fā)現(xiàn)ARFI在評估肝纖維化程度方面具有一定的診斷價值［11-12］，提示可以用來評估肝纖維化的嚴(yán)重程度。

本研究構(gòu)建了不同程度的兔肝纖維化模型，進行ARFI檢查，將此方法獲得的彈性參數(shù)與所測肝纖維化病理分期進行對照研究，尋找能準(zhǔn)確評價肝纖維化程度的指標(biāo)，并獲取該參數(shù)的截斷值，為臨床診斷及治療肝纖維化提供理論依據(jù)。

本研究價值：

肝纖維化是肝硬化、肝細胞癌的前期病變，肝穿刺活檢術(shù)是肝纖維化病理分期診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但此方法具有侵入性、臨床禁忌證多等缺點而限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用，本研究通過建立兔肝纖維化模型，探討了應(yīng)用聲脈沖輻射力彈性成像（ARFI）評估兔肝纖維化程度的診斷價值，發(fā)現(xiàn)ARFI對肝纖維化具有較高的診斷效能，值得臨床推廣應(yīng)用，為臨床無創(chuàng)評估肝纖維化程度提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 兔肝纖維化模型的建立方法 2015年4—10月，選用健康新西蘭大白兔44只，隨機選取36只作為實驗組，8只作為對照組。實驗組給予皮下注射四氯化碳（CCl4）16周建立兔肝纖維化模型，起始劑量為0.3 ml/kg，劑量遞增，第4周劑量為0.4 ml/kg，第5周后劑量為0.5 ml/kg；對照組給予相同劑量0.9%氯化鈉溶液。

1.2 ARFI檢查活體兔肝硬度 活體兔ARFI檢查使用西門子公司生產(chǎn)的Acuson S2000彩色多普勒超聲診斷儀，9L4探頭，頻率4～9 MHz，配置VTQ定量分析系統(tǒng)，于造模第4、6、8、10、12、14周，分別從實驗組隨機選取3～6只兔，對照組隨機選取1～2只兔，造模第16周選取剩余的實驗組及對照組兔進行檢查。所有需行檢查的兔當(dāng)日禁食水，保證至少空腹8 h。8%水合氯醛鹽溶液2 ml/kg耳緣靜脈緩慢推注。麻醉后仰臥位固定于兔臺，使用電推剪剃掉其腹部毛發(fā)，范圍為上至胸骨中段，下至恥骨聯(lián)合，充分暴露其腹部后做好保溫措施，即刻將其送至腹部彩超室接受檢查。檢查過程中保證其固定良好，探頭涂抹足量耦合劑，由同1名高年資超聲醫(yī)師對所有受試兔進行超聲檢查，包括常規(guī)超聲檢查及ARFI檢查，即先用二維超聲檢查兔肝臟，觀察整體肝臟聲像圖，常規(guī)超聲檢查包括肝臟大小、形態(tài)、輪廓、表面、邊緣狀態(tài)、實質(zhì)回聲。在二維超聲檢查的基礎(chǔ)上，選取肋緣下肝切面為檢測部位并固定探頭，采用ARFI檢測兔肝臟橫向SWV（m/s）。ROI的選擇應(yīng)避開肝內(nèi)管道系統(tǒng)，取樣深度為0.5～2.0 cm，檢測10次，記錄數(shù)據(jù)并留取檢測圖像。

1.3 ARFI檢查離體兔肝硬度 活體兔肝SWV檢測完成后，快速結(jié)扎兔肝臟血管及周圍韌帶并游離出兔肝臟，然后取出兔肝在肝右葉行ARFI檢查。離體兔肝SWV記為SWV1，測量深度距肝包膜0.5～2.0 cm，檢查10次，記錄數(shù)據(jù)并留取檢測圖像。

1.4 兔肝組織學(xué)檢查與肝纖維化病理分期診斷 SWVI測量完成后，使用空氣栓塞法處死兔，取測量取樣框所置部位的肝組織標(biāo)本，先使用兔蘇木素-伊紅（HE染色）染色再進行Masson染色法染色，染色后的切片均由病理科主治醫(yī)師及以上職稱的醫(yī)生獨立盲法閱片診斷。肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)Metavir分期法［13］（2000年全國病毒性肝炎病理診斷標(biāo)準(zhǔn)）分為0～4期，F(xiàn)0期：無纖維化；F1期：匯管區(qū)纖維化但無纖維間隔形成；F2期：匯管區(qū)纖維化有少許纖維間隔伴生；F3期：大量纖維間隔形成；F4期：肝硬化，假小葉形成，伴或不伴炎性壞死。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0及Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（±s）表示，不同肝纖維化病理分期組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。繪制SWV、SWV1評估肝纖維化的受試者工作特征（ROC）曲線，計算ROC曲線下面積（AUC），確定截斷值、靈敏度、特異度。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔肝纖維化病理學(xué)分期 造模期間的死亡兔肝組織表面光滑，質(zhì)地較軟，病理檢查顯示不同程度肝細胞腫脹、壞死，未見肝纖維化形成。至造模第16周時，成功建立各分期的兔肝纖維化模型（見表1）。病理檢查結(jié)果示：對照組兔肝臟病理學(xué)檢查均正常，無纖維化；實驗組36只兔最終死亡4只，造模成功32只，肝纖維化分期為F1期6只、F2期10只、F3期8只、F4期8只（見圖1），造模成功率為88.9%（32/36）。

2.2 ARFI檢查兔肝纖維化硬度 實驗組32只造模成功兔及對照組8只兔均完成ARFI檢查并成功獲取活體兔肝SWV及離體兔肝SWV1。對照組和實驗組肝纖維化各期SWV、SWV1比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；其中實驗組F1～F4期的SWV、SWV1大于對照組，實驗組F2～F4期的SWV、SWV1大于實驗組F1期，實驗組F3～F4期的SWV、SWV1大于實驗組F2期，實驗組F4期SWV1大于實驗組F3期，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組及實驗組F1～F4期SWV1均大于SWV，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2，圖2～3）。

2.3 ARFI評估兔肝纖維化程度的診斷效能 ARFI診斷肝纖維化分期≥F2期、≥F3期及F4期的AUC均＞0.9，SWV診斷肝纖維化≥F2期、≥F3期及F4期的截斷值分別為2.21、2.29、2.36 m/s，靈敏度分別為80.8%、87.5%、87.5%，特異度分別為83.3%、87.5%、79.3%；SWV1診斷肝纖維化≥F2期、≥F3期及F4期的截斷值分別為2.58、2.92、3.26 m/s，靈敏度分別為80.8%、81.3%、87.5%，特異度分別為83.3%、87.5%、95.8%（見表3、圖4～6）。

3 討論

本研究采用皮下注射CCl4的方法成功制備了兔肝纖維化各期模型，實驗組兔造模成功率為88.9%。采用皮下注射CCl4的方法制備兔肝纖維化模型具有穩(wěn)定性好、成模率高等特點，適合推廣使用。

ARFI融合了生物力學(xué)和影像學(xué)的技術(shù)，是目前較新的能定量評估組織硬度的方法［14-16］。ARFI通過測量其橫向SWV來間接反映ROI肝組織的硬度，在檢查中不受肋間隙狹窄及肥胖的限制［17］。研究發(fā)現(xiàn)ARFI彈性參數(shù)SWV與病理肝纖維化分期間有較好的相關(guān)性，SWV隨肝纖維化的加重而增加，提示SWV可用于評估肝纖維化程度［16］。

表1 造模后不同時間點兔肝纖維化分期（只）Table 1 Staging of liver fibrosis of rabbits in experimental group sacrificed between the 4th and the 16th weeks of modeling

表2 對照組和實驗組兔纖維化各期SWV、SWV1比較（±s，m/s）Table 2 Comparison of the value of SWV and SWV1 in different stages of liver fibrosis

表2 對照組和實驗組兔纖維化各期SWV、SWV1比較（±s，m/s）Table 2 Comparison of the value of SWV and SWV1 in different stages of liver fibrosis

注：SWV為活體兔肝剪切波速度，SWV1為離體兔肝剪切波速度；與對照組比較，aP＜0.05；與實驗組F1期比較，bP＜0.05；與實驗組F2期比較，cP＜0.05；與實驗組F3期比較，dP＜0.05；與SWV比較，eP＜0.05

組別 只數(shù) SWV SWV1對照組 8 1.12±0.05 1.33±0.04e實驗組F1期 6 1.95±0.11a 2.29±0.06ae F2期 10 2.23±0.12ab 2.80±0.21abe F3 期 8 2.39±0.05abc 3.09±0.20abce F4期 8 2.50±0.06abc 3.59±0.10abcde F值 333.536 262.636 P值 ＜0.001 ＜0.001

圖1 兔肝纖維化病理分期檢查結(jié)果（Masson染色，×40）Figure 1 Pathological fibrosis staging in rabbits'liver tissue

圖2 ARFI檢查活體兔肝SWV結(jié)果Figure 2 Elastic parameters SWV of live rabbits detected by ARFI

圖3 ARFI檢查離體兔SWV1結(jié)果Figure 3 Elastic parameters SWV1 of rabbits' liver in vitro detected by ARFI

表3 ARFI診斷兔肝纖維化的診斷效能Table 3 Diagnostic efficiency of ARFI in the assessment of the stage of liver fibrosis in rabbitsFeatures

本研究結(jié)果顯示，SWV、SWV1均可用于評估肝纖維化程度，SWV診斷肝纖維化分期≥F2期、≥F3期、F4期的AUC分別為0.901、0.939、0.945，截斷值分別為2.21、2.29、2.36 m/s；SWV1診斷肝纖維化分期≥F2期、≥F3期、F4期的AUC分別為0.901、0.901、0.958，截斷值分別為2.58、2.92、3.26 m/s。提示ARFI對兔肝纖維化具有較好的評價效能。本研究中肝纖維化分期F3期與F4期的SWV間無明顯差異，與孫德勝等［18］的研究結(jié)果相似，提示肝纖維化分期之間的SWV存在重疊現(xiàn)象。

圖4 SWV、SWV1診斷肝纖維化≥F2期的ROC曲線Figure 4 ROC curves of SWV and SWV1 for the diagnosis of ≥F2 stage liver fibrosis

圖5 SWV、SWV1診斷肝纖維化≥F3期的ROC曲線Figure 5 ROC curves of SWV and SWV1 for the diagnosis of ≥F3 stage of liver fibrosis

圖6 SWV、SWV1診斷肝纖維化F4期的ROC曲線Figure 6 ROC curves of SWV and SWV1 for the diagnosis of F 4 stage liver fibrosis

HORSTER等［19］研究顯示皮膚到肝包膜的距離每增加1 cm，SWV下降0.132。本研究顯示離體兔肝SWV1值較SWV高，提示其穩(wěn)定性更好，這可能跟呼吸有關(guān)，因?qū)嶒瀯游餆o法自主屏氣，本課題組在進行活體兔SWV檢測時，探頭位于皮膚上，因此受呼吸影響較大，而離體檢測時探頭直接置于肝表面，不受呼吸影響，測量值相對更穩(wěn)定。

目前ARFI技術(shù)已廣泛應(yīng)用于乳腺、甲狀腺、肝臟等臟器腫瘤的定性診斷及化療后的療效監(jiān)測，并取得了一定的效果。本研究結(jié)果顯示新西蘭大白兔ARFI SWV、SWV1均可用于評估肝纖維化程度。SWV、SWV1診斷兔各期肝纖維化程度的AUC均大于0.9。通常AUC越大，診斷的準(zhǔn)確性越高，當(dāng)其大于0.8時常被認(rèn)為是具有較好診斷效能的標(biāo)準(zhǔn)，因此本研究結(jié)果表明SWV、SWV1具有較好的診斷兔肝纖維化程度的臨床價值。

綜上所述，ARFI技術(shù)可以用來評估兔肝纖維化程度，其診斷兔各期肝纖維化的AUC均大于0.9，具有較好的診斷效能。

作者貢獻：李軍進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；童瑾、徐麗紅、李軍進行研究的實施與可行性分析；童瑾、曹春莉、馬婷、劉閃閃、康燕飛、杜婷婷進行數(shù)據(jù)收集、整理；童瑾進行統(tǒng)計學(xué)處理，并撰寫論文；童瑾、曹春莉進行結(jié)果的分析與解釋；童瑾、李軍進行論文的修訂，對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。