張 研 蔣鴻陽 劉殿媛 李盛學(xué) 王 清
作者單位:吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 內(nèi)分泌代謝科 130033
近年來腸道菌群與2型糖尿病的關(guān)系越來越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[1]。腸道菌群變化與宿主的胰島素抵抗、肥胖、全身炎癥和氧化應(yīng)激密切相關(guān)[2]。腸道菌群失調(diào)加重胰島素抵抗而影響糖代謝及其并發(fā)癥的進(jìn)展。本研究擬在2型糖尿病患者中采用益生菌干預(yù),研究腸道菌群的變化,探討該干預(yù)方式的臨床應(yīng)用價(jià)值。
1.1 研究對(duì)象 選取2017年1月至7月在中日聯(lián)誼醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科就診的2型糖尿病患者為受試者,需滿足7.0%≤HbA1c≤10.0%,共入組101人,糖尿病病史1周~26年;所有受試者了解研究方案后參加試驗(yàn),自愿遵從研究者的指導(dǎo),簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):伴有嚴(yán)重的肝腎功能受損、心衰、發(fā)熱、感染、糖尿病急性并發(fā)癥以及妊娠和哺乳期婦女、空腹血糖≥13.3mmol/L,嚴(yán)重高血壓(收縮壓≥180mmHg和/或舒張壓≥110mmHg)以及研究者認(rèn)為不適合加入者。2型糖尿病診斷符合1999年制定的WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。
1.2 研究方案 所有受試者由專人進(jìn)行病史采集,記錄性別、年齡、病程、身高、體重、血壓。囑受試者規(guī)律飲食,指導(dǎo)患者每日運(yùn)動(dòng)量相近,在降糖方案不變的基礎(chǔ)上,每日服用益生菌產(chǎn)品,包括長(zhǎng)樂膠囊3粒,每日3次口服,洚糖奇沖劑1袋,每日2次餐前1.5小時(shí)沖服(均為吉林天三奇藥業(yè)有限公司生產(chǎn))進(jìn)行聯(lián)合干預(yù),總療程24周。長(zhǎng)樂膠囊是以玉米粉、大米粉、脫脂乳粉、小麥粉、脫脂大豆粉、低聚異麥芽糖、白砂糖、葡萄糖、酵母浸膏為主要原料制成的保健食品,每100g中含兩歧雙歧桿菌1.2×108CFU、嗜酸乳桿菌4.2×108CFU、嗜熱鏈球菌4.3×108CFU;洚糖奇沖劑的成分為豆粉、奶粉、可可粉、鈣粉、山藥粉、魔芋粉、螺旋藻粉、杏仁粉、烏梅粉、甘草粉等,餐前服用可以增加飽腹感,其中的碳水化合物起到類似益生元的作用。所有受試者在試驗(yàn)期間維持原有降糖、降壓、調(diào)脂等治療方案不變,共101人入組,75人完成臨床觀察安全出組。
1.3 檢測(cè)指標(biāo) 每個(gè)受試者檢測(cè)基線和終點(diǎn)時(shí)空腹血糖(FBG)、餐后2小時(shí)血糖、血脂、肝功、腎功、尿常規(guī)、空腹C肽(FCP)、糖化血紅蛋白(HbA1c)等指標(biāo)。留取受試者基線和終點(diǎn)時(shí)糞便進(jìn)行腸道菌群16srRNA高通道測(cè)序(委托微基生物科技(上海)有限公司進(jìn)行),對(duì)樣本腸道微生物多樣性進(jìn)行鑒定和分析。胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR=(FCP×FBG)/22.5。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 正態(tài)分布資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用配對(duì)t檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析;非正態(tài)分布資料用中位數(shù)(四分位數(shù))表示,采用配對(duì)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2.1 聯(lián)合干預(yù)對(duì)受試者一般情況、血糖、血脂和胰島素抵抗水平的影響 完成臨床觀察者共75例(平均年齡56.5±7.5歲),男性25例,女性50例。受試者終點(diǎn)時(shí)體重、收縮壓和舒張壓較基線水平下降,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。空腹血糖明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),餐后2小時(shí)血糖及糖化血紅蛋白下降,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。將HbA1c<7.0%定義為達(dá)標(biāo),入組時(shí)受試者HbA1c達(dá)標(biāo)率為27.7%,出組時(shí)HbA1c達(dá)標(biāo)率為35.6%。聯(lián)合干預(yù)對(duì)血脂的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。將甘油三酯<1.7mmol/L定義為達(dá)標(biāo),入組時(shí)甘油三酯達(dá)標(biāo)率為38.6%,出組時(shí)達(dá)標(biāo)率為52.5%。將總膽固醇<5.2mmol/L定義為達(dá)標(biāo),入組時(shí)總膽固醇達(dá)標(biāo)率為44.6%,出組時(shí)達(dá)標(biāo)率為61.4%。受試者空腹C肽水平在干預(yù)前后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,用HOMA-IR代表胰島素抵抗水平,干預(yù)后受試者終點(diǎn)HOMA-IR下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),胰島素抵抗得到改善。
表1 聯(lián)合干預(yù)對(duì)受試者血糖、血脂、胰島素抵抗的影響
注:*P<0.05。
2.2 安全性 訪視期間所有受試者未出現(xiàn)嚴(yán)重低血糖及心腦血管事件,聯(lián)合干預(yù)前后受試者肝功、腎功未見明顯改變。
圖1 各樣本OUTs稀釋曲線圖
圖2 各樣本shannon指數(shù)曲線圖
圖3 各樣本Runk-Abundance曲線圖
圖4 各樣本門水平聚類樹與柱狀圖
2.3 腸道菌群測(cè)序結(jié)果 收集所有受試者糞便后,提取DNA樣本以及OUT生成均由測(cè)序公司完成,共得到有效樣本70例,pre-代表干預(yù)前樣本,post-代表干預(yù)后樣本。①Alpha多樣性分析:利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件獲得chao指數(shù)代表菌群豐度,shannon指數(shù)代表菌群多樣性,各樣本OUTs稀釋曲線如圖1所示,shannon稀釋曲線如圖2所示,不同顏色曲線代表不同樣本,隨測(cè)序量增加,各樣本稀釋曲線趨于平緩,說明樣本測(cè)試深度足夠,樣本物種豐富,測(cè)序量足夠大,能夠反映樣本中的微生物信息。各樣本Runk-Abundance曲線如圖3所示,隨樣本菌群數(shù)量增加,各樣本菌種豐度減少,當(dāng)菌種豐度低于1E-04時(shí),曲線接近平臺(tái)期,大多數(shù)樣本菌屬在100~200之間。②菌群結(jié)構(gòu)及聚類分析:圖4所示所有樣本在門水平的菌群結(jié)構(gòu),其中厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)在各樣本中所占比例較高,為優(yōu)勢(shì)菌群;共22例樣本中軟壁菌門(Tenericutes)比例較高,其中Pre-組8例,占24.2%,Post-組14例,占37.8%;共32例樣本防線菌門(Actinobacteria)比例較高,Pre-組4例,占12.1%,Post-組28例,占75.7%;5例樣本藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)比例略高,Pre-組2例和Post-組3例,說明干預(yù)后各樣本菌群比例發(fā)生了改變,干預(yù)后放線菌門和軟壁菌門豐度增加。聚類分析顯示pre-組代表基線狀態(tài)和post-組代表終點(diǎn)狀態(tài),總體表現(xiàn)為pre-組和post-組首先在同組樣本中聚類,圖3所示門水平相似性分析樹狀圖中最上方9例post-組樣本聚類在一起,下方接著有7例和8例pre-組樣本聚類后合并,說明同組樣本的腸道菌群具有較高的相似性。整體樹狀圖中會(huì)有pre-組和post-組交叉聚類的地方,這與糖尿病患者腸道菌群的復(fù)雜性和混雜因素較多有關(guān)。③屬水平分析顯示,與基線時(shí)比較終點(diǎn)時(shí)受試者腸道益生菌數(shù)量增多者和條件致病菌數(shù)量減少的例數(shù)均增加,益生菌中防線菌門分支下的雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)數(shù)量增多者占62.2%、厚壁菌門分支下的乳桿菌屬(Lactobacillus)-嗜酸乳桿菌(L.Lactobacillus)數(shù)量增多者占21.6%;條件致病菌中埃希菌屬(Escherichia)的大腸埃希菌(Escherichia coli)數(shù)量減少者占29.7%,腸球菌屬(Enterococcus)數(shù)量減少者占43.2%。進(jìn)一步提示益生菌能夠提高部分糖尿病患者腸道菌群中有益細(xì)菌比例,同時(shí)減少有害菌比例。
腸道共生菌及其代謝產(chǎn)物通過影響宿主的代謝和免疫系統(tǒng)參與代謝異常和疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)糖代謝異?;颊甙橛心c道菌群失衡,一方面革蘭氏陰性細(xì)菌增多,產(chǎn)生脂多糖(LPS)水平增加,LPS進(jìn)入人體被免疫細(xì)胞識(shí)別后產(chǎn)生多種炎癥因子,誘導(dǎo)全身慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展[3,4];另一方面產(chǎn)丁酸鹽的細(xì)菌減少,其增加胰島素敏感性、減輕炎癥反應(yīng)、保護(hù)腸道黏膜的屏障作用也隨之減弱,進(jìn)而誘發(fā)糖尿病的發(fā)生發(fā)展[5]。宏基因組(Metagenome)技術(shù)是指不經(jīng)過微生物培養(yǎng)階段,直接提取環(huán)境中總DNA對(duì)微生物基因總和進(jìn)行研究的技術(shù)。本研究采用16SrRNA高通道測(cè)序技術(shù)是宏基因組技術(shù)中的主要方法,細(xì)菌16SrRNA基因可變區(qū)具有菌種特異性,分析可變區(qū)序列即可得到各細(xì)菌的分類學(xué)特征,相比于傳統(tǒng)PCR方法更為準(zhǔn)確和特異。本研究對(duì)2型糖尿病患者給予口服益生菌聯(lián)合干預(yù)24周后,對(duì)基線和干預(yù)后的腸道細(xì)菌通過高通道測(cè)序進(jìn)行分類鑒定和精確定量,結(jié)果顯示所有受試者各樣本測(cè)試深度足夠,樣本物種豐富,能夠反映樣本中的微生物信息。本研究中2型糖尿病受試者腸道中厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌群,干預(yù)24周后軟壁菌門、防線菌門、藍(lán)藻菌門在干預(yù)后樣本中增加的例數(shù)明顯增加,說明干預(yù)后各樣本菌群結(jié)構(gòu)比例發(fā)生了改變。研究顯示1型糖尿病患者中放線菌門/厚壁菌門、厚壁菌門/擬桿菌門的比例降低,有益菌群產(chǎn)生丁酸鹽的細(xì)菌含量減少[6],本研究測(cè)序結(jié)果與之類似,干預(yù)后部分樣本中軟壁菌門、防線菌門、藍(lán)藻菌門比例顯著增加,且厚壁菌門中的益生菌乳桿菌屬增加。聚類分析時(shí)post-組樣本和pre-組樣本多數(shù)能夠同組間聚類,說明本研究中服用益生菌改變了2型糖尿病患者腸道菌群各細(xì)菌種類的比例,并且菌群變化有相似之處。
對(duì)比基線和終點(diǎn)狀態(tài)受試者的糖脂代謝指標(biāo)發(fā)現(xiàn),干預(yù)后受試者空腹血糖顯著改善,血脂達(dá)標(biāo)率提高,HOMR-IR指數(shù)降低,胰島素抵抗得到改善。終點(diǎn)時(shí)受試者腸道益生菌數(shù)量增多和條件致病菌數(shù)量減少的例數(shù)均增加,益生菌中防線菌門分支下的雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)數(shù)量增多者占62.2%、厚壁菌門分支下的乳桿菌屬(Lactobacillus)-嗜酸乳桿菌(L.Lactobacillus)數(shù)量增多者占21.6%,結(jié)合本研究方案考慮與益生菌干預(yù)有關(guān)。長(zhǎng)樂膠囊中含兩歧雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌三種益生菌,無降血糖成分;洚糖奇沖劑無直接降低血糖的成分,是通過餐前服用增加飽腹感,減少其他食物的攝入,能很好地控制患者的飲食變異,其中的碳水化合物起到類似益生元的作用,有利于益生菌的吸收和腸道內(nèi)繁殖。本研究中采取增加益生菌攝入的聯(lián)合干預(yù),能夠有效補(bǔ)充腸道益生菌/益生元,調(diào)節(jié)脂肪酸的代謝,從而調(diào)節(jié)2型糖尿病患者的腸道菌群,進(jìn)而改善終點(diǎn)時(shí)的空腹血糖。動(dòng)物研究顯示對(duì)高脂喂養(yǎng)的大鼠提前喂飼益生菌,對(duì)大鼠2型糖尿病的形成和發(fā)展具有一定的預(yù)防作用,其降糖作用與改善腸道菌群結(jié)構(gòu),抑制有害菌繁殖,降低炎性因子TNF-a、IL-6等的表達(dá)有關(guān)[7]。Amar等發(fā)現(xiàn)動(dòng)物雙歧桿菌乳酸菌能夠改變高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠早期的細(xì)菌易位,從而降低組織中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1b、PAI-1和IL-6的表達(dá),改善胰島素敏感性和葡萄糖代謝[8]。因此現(xiàn)在有很多學(xué)者認(rèn)為益生菌作為一類調(diào)節(jié)宿主腸道微生態(tài)平衡的活性微生物,可通過改變腸道菌群及其代謝產(chǎn)物進(jìn)而改善機(jī)體能量代謝、減輕慢性炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。益生菌的應(yīng)用已逐漸成為預(yù)防和控制2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的研究熱點(diǎn)[9]。
本研究通過增加益生菌攝入,患者肝腎功能未見明顯異常,受試者無明顯不適,安全性較好。雖然研究結(jié)果顯示干預(yù)后腸道菌群發(fā)生變化,糖代謝、胰島素抵抗和脂代謝得到改善,但是由于干預(yù)前分組不夠嚴(yán)格以及混雜因素較多,不能很好進(jìn)行相關(guān)分析和歸因分析,在后續(xù)研究中應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步嚴(yán)格分組和增加樣本量,同時(shí)測(cè)定炎癥指標(biāo)和氧化應(yīng)激指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析和歸因分析。綜上,腸道益生菌的攝入能夠調(diào)節(jié)2型糖尿病患者的腸道菌群,促進(jìn)空腹血糖達(dá)標(biāo)和改善胰島素抵抗,有利于脂代謝達(dá)標(biāo)。