煙草煙霧對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠發(fā)病的影響

謝建平 王趙偉 吳承龍 歷莎

煙草煙霧是哮喘、慢性支氣管炎等呼吸道慢性炎癥疾病的危險因素。煙草煙霧進(jìn)入氣道后還能通過肺組織免疫活性細(xì)胞影響全身免疫功能狀態(tài)[1-2]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病是一類自身免疫性疾病，遺傳及環(huán)境因素與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近期研究發(fā)現(xiàn)，煙草煙霧暴露是疾病的重要環(huán)境因素，但是研究證據(jù)尚不充分[3-4]。煙草煙霧室內(nèi)污染在我國仍普遍存在，但對中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病的危害尚不明確也未引起重視[5]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是疾病動物模型。為探討煙草煙霧暴露對EAE的影響，筆者在制作大鼠EAE模型后進(jìn)行煙草煙霧暴露處理，觀察大鼠行為學(xué)改變和星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟樹突狀細(xì)胞比例及細(xì)胞表型變化，初步探索相關(guān)免疫機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動物和試劑 清潔級8周齡SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司；完全弗氏佐劑購自美國Sigma-Aldrich公司；卡介苗購自中國食品藥品檢定研究院；FITC標(biāo)記的MHC-Ⅱ抗體、APC標(biāo)記的CD11c/b抗體及PE標(biāo)記的CD86抗體購自美國eBioscience公司；小鼠抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）一抗與小鼠IgG kappa結(jié)合蛋白偶聯(lián)辣根過氧化物酶購自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司。FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；某市售普通卷煙（每支含焦油11mg，煙堿1mg，一氧化碳11mg）。

1.2 動物分組及EAE模型制作 38只8周齡SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后分為3組，其中空白對照組6只，空氣組與煙草煙霧組各16只?？諝饨M與煙草煙霧組參考文獻(xiàn)[6] 制作EAE模型：10%水合氯醛腹腔注射麻醉豚鼠，再用左心室灌注0.9%氯化鈉溶液直到肝臟變白，再分離豚鼠脊髓，去除脊膜；加入等量無菌0.9%氯化鈉溶液后4℃環(huán)境勻漿。新鮮配制的豚鼠脊髓勻漿液與完全弗氏佐劑（含卡介苗8mg/ml）等體積混合，用2個注射器鏈接后于0℃冰水中反復(fù)抽打，直到形成油包水乳劑?，F(xiàn)配上述乳劑用1ml皮試用注射器皮下注射于大鼠四肢足墊（0.4ml/只）?？瞻讓φ战M不建EAE模型，同期注射0.9%氯化鈉溶液與完全弗氏佐劑混合的乳劑。空白對照組用于空氣組與煙草煙霧組發(fā)病大鼠對照，比較發(fā)病大鼠的行為學(xué)變化以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。皮下注射乳劑當(dāng)天記為第0天。

1.3 煙草煙霧暴露 在EAE造模后進(jìn)行煙草煙霧暴露或壓縮空氣暴露。參考文獻(xiàn)[7] 方法自制煙霧暴露系統(tǒng)，其中煙箱的容積為57.6dm2。煙草煙霧組在第1天到第20天每日8:00～11:00進(jìn)行煙草煙霧暴露。煙草煙霧暴露時煙箱CO濃度維持在500mg/m3?？瞻讓φ战M與空氣組在第1天到第20天每日8:00～11:00進(jìn)行壓縮空氣暴露。1.4 行為學(xué)評分 從EAE造模當(dāng)天到大鼠被處死，按參考文獻(xiàn)提供的標(biāo)準(zhǔn)[6]每天觀察記錄大鼠行為學(xué)評分。評分標(biāo)準(zhǔn)最高為5分，最低為0分。0分：無明顯異常；1分：尾巴無力；2分：輕微后肢無力；3分：嚴(yán)重后肢麻痹；4分：四肢麻痹；5分：瀕死或死亡。每天評分2次，均值為當(dāng)日最終評分。從模型誘導(dǎo)到發(fā)病的時間段為潛伏期。整個觀察期內(nèi)行為學(xué)評分最大值定義為最高行為學(xué)評分。從EAE發(fā)病到觀察期結(jié)束，每日行為學(xué)評分累積值定義為累積行為學(xué)評分。

1.5 星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 采用免疫組織化學(xué)染色法。造模后第20天，采用10%水合氯醛麻醉大鼠后用無菌PBS灌注左心室的方法處死。分離腦脊髓組織后放入編號的容器內(nèi)（含40g/L多聚甲醛）固定24h。再常規(guī)脫水、透明、浸蠟制成蠟塊，切片、烤片后行免疫組化染色。其中染色步驟：石蠟切片脫蠟至水，高壓鍋加熱進(jìn)行抗原修復(fù)（含0.01M的檸檬酸緩沖液中），PBS洗滌3次；滴加 GFAP一抗（1:300）后 4℃過夜，PBS洗滌 3次；滴加 m-IgGκBP-HRP（1:100）孵育 120min，PBS 洗滌3次；滴加DAB工作液（注意在光鏡下控制顯色時間）；去離子水洗滌；梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。每張切片隨機(jī)取3個視野觀察陽性細(xì)胞形態(tài)、分布。

1.6 脾臟樹突狀細(xì)胞比例及細(xì)胞表型變化檢測 分離脾臟后用注射器針頭反復(fù)穿刺獲得脾臟細(xì)胞；用紅細(xì)胞裂解液處理15min；離心5min（500g）后用PBS重懸洗滌2次；細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)并稀釋到濃度為107/ml；用移液器吸取100μl于EP管，依次加入抗CD11c/b（樹突狀細(xì)胞標(biāo)志物）、CD86和MCH-Ⅱ抗體，冰浴暗室孵育30min；PBS洗2次后上機(jī)檢測（FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀）樹突狀細(xì)胞比例、CD86+樹突狀細(xì)胞比例和MHC-Ⅱ+樹突狀細(xì)胞比例。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。不符合正態(tài)的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用 Mann-WhitneyU檢驗；符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 煙草煙霧組與空氣組大鼠潛伏期、行為學(xué)評分比較 空白對照組未發(fā)病?？諝饨M與煙草煙霧組大鼠在造模第9天左右開始發(fā)病，主要表現(xiàn)為進(jìn)食及飲水量下降，行走時尾部上翹困難，步態(tài)拖沓。隨著病情加重，出現(xiàn)肢體無力，多以下肢無力開始，逐漸發(fā)展到四肢無力，甚至瀕死狀態(tài)，但沒有出現(xiàn)死亡。與空氣組比較，煙草煙霧組潛伏期更短，最高行為學(xué)評分、觀察期內(nèi)累積行為學(xué)評分更高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 煙草煙霧組與空氣組大鼠潛伏期、行為學(xué)評分比較

2.2 3組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化 免疫組化染色顯示，相對于空白對照組，空氣組與煙草煙霧組大鼠腦組織均存在星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大，突起粗大并且增多。相對于空氣組，煙草煙霧組大鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞突起更為粗大，分布也更為廣泛，見圖1。

圖1 3組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化（a：空白對照組；b：空氣組；c：煙草煙霧組；免疫組化染色，×200）

2.3 煙草煙霧組與空氣組大鼠脾臟樹突狀細(xì)胞表型的變化 煙草煙霧組與空氣組大鼠脾臟樹突狀細(xì)胞比例和CD86+樹突狀細(xì)胞比例比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），但煙草煙霧組大鼠MHC-Ⅱ+樹突狀細(xì)胞比例高于空氣組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2和圖2。

表2 煙草煙霧組與空氣組大鼠脾臟樹突狀細(xì)胞表型的變化（%）

圖2 脾臟CD86+、MHC-Ⅱ+樹突狀細(xì)胞比例比較（a：空氣組樹突狀細(xì)胞比例；b：煙草煙霧組樹突狀細(xì)胞比例；c：空氣組CD86+、MHC-Ⅱ+樹突狀細(xì)胞比例；d：煙草煙霧組CD86+、MHC-Ⅱ+樹突狀細(xì)胞比例）

3 討論

煙草煙霧對于健康的危害是多方面的，研究發(fā)現(xiàn)其是多發(fā)性硬化等中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病的重要危險因素[3,8]。通過SD大鼠EAE動物模型，筆者發(fā)現(xiàn)煙草煙霧組與空氣組比較，發(fā)病潛伏期縮短，最高行為學(xué)評分與累積行為學(xué)評分均更高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。可見在疾病的啟動階段到疾病發(fā)展階段，煙草煙霧的吸入對EAE具有潛在的促發(fā)效應(yīng)。進(jìn)一步通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞在煙草煙霧暴露EAE大鼠中增生反應(yīng)更加明顯，表現(xiàn)為胞體變大，突起更為粗大，這提示星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了中樞炎癥性反應(yīng)，并可能與疾病的惡化存在潛在的關(guān)聯(lián)?？瞻讓φ战M大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞與空氣組及煙草煙霧組相比，細(xì)胞體積較小，突起也較為細(xì)小。且空白對照組均未出現(xiàn)行為學(xué)異常，結(jié)合上述兩點(diǎn)，提示星型膠質(zhì)細(xì)胞參與EAE中樞炎癥性反應(yīng)，其增值性反應(yīng)可能是EAE炎癥的標(biāo)志物。

煙草煙霧的吸入包括主動吸煙與被動吸煙。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)多發(fā)性硬化患者主動抽煙人群生活質(zhì)量下降及疾病惡化情況較未吸煙人群更為明顯[9]，盡管主動抽煙與煙草煙霧被動吸入都可能加重此類疾病，但是目前機(jī)制還不明確[10-11]。

有研究發(fā)現(xiàn)煙草煙霧吸入可導(dǎo)致外周免疫調(diào)節(jié)性CD4CD25+T細(xì)胞比例下調(diào)，而IL-17+T細(xì)胞比例升高[12-13]，這種細(xì)胞免疫平衡紊亂可能是自身免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。上述成熟的CD4+T細(xì)胞的發(fā)育與抗原遞呈細(xì)胞的免疫表型有密切關(guān)系。樹突狀細(xì)胞就是最為常見的外周抗原遞呈細(xì)胞，其免疫表型變化影響著幼稚T細(xì)胞的發(fā)育成熟。本研究發(fā)現(xiàn)，煙草煙霧組與空氣組樹突狀細(xì)胞比例和CD86+樹突狀細(xì)胞比例比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但煙草煙霧組大鼠MHC-Ⅱ+樹突狀細(xì)胞比例高于空氣組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。筆者推測煙草煙霧可能會影響樹突狀細(xì)胞MHC-Ⅱ表達(dá)上調(diào)，改變成熟CD4+T、CD8+T細(xì)胞表型以及功能，最終造成EAE發(fā)病過程中的細(xì)胞免疫功能紊亂。后續(xù)研究需要關(guān)注煙草煙霧對于樹突狀細(xì)胞、CD4+T、CD8+T細(xì)胞的分化與免疫功能的影響，以及與EAE中樞炎癥啟動、效應(yīng)等階段的關(guān)系。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)煙草煙霧暴露與EAE病情惡化可能有關(guān)，并且伴隨著過度增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞。煙草煙霧可能通過促進(jìn)樹突狀細(xì)胞MHC-Ⅱ表達(dá)上調(diào)促進(jìn)致病性淋巴細(xì)胞活化，造成EAE發(fā)病加重。