江蘇鹽城原生濱海濕地土壤細菌群落多樣性分析

趙婧 祝遵凌

摘要：以江蘇鹽城原生濱海濕地蘆葦灘、蘆葦堿蓬灘、堿蓬灘、堿蓬米草灘、互花米草灘、青蛤灘這6種典型灘面為研究對象，采用高通量測序方法測定土壤細菌群落的功能多樣性，利用冗余分析細菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系，以探討濱海濕地土壤細菌群落結(jié)構(gòu)空間分布及環(huán)境影響因子。結(jié)果表明，濱海濕地土壤理化指標(biāo)有明顯差異，由蘆葦灘到青蛤灘，土壤pH值呈逐漸上升趨勢，土壤有機碳（SOC）、全氮（TN）、銨態(tài)氮（NH+4-N）、硝態(tài)氮（NO3--N）含量呈逐漸降低趨勢，土壤全磷（TP）含量變化趨勢不明顯;濱海濕地30個土壤樣品高通量測序共得到50 172條高質(zhì)量序列，平均長度為8 362 bp，有97%相似，土壤樣品文庫的覆蓋率范圍為98.04%～99.56%;不同土壤細菌群落豐度指數(shù)與Shannon指數(shù)排序一致，為蘆葦灘>蘆葦堿蓬灘>堿蓬灘>堿蓬米草灘>互花米草灘>青蛤灘，豐度相對較高的細菌門為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門，豐度值分別為27.26%～33.06%、23.47%～29.03%、15.03%～19.02%，主要的優(yōu)勢菌綱為α-變形菌綱、放線菌綱、酸桿菌綱;由蘆葦灘到青蛤灘，土壤細菌Chao、Ace、Shannon指數(shù)、OTU數(shù)量呈逐漸降低趨勢，土壤細菌覆蓋率、Simpson指數(shù)沒有明顯規(guī)律性變化;土壤pH值、SOC含量、NH4+-N含量是濱海濕地土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的主要影響因子。

關(guān)鍵詞：濱海濕地;土壤細菌;群落結(jié)構(gòu);江蘇鹽城;蘆葦灘;青蛤灘

中圖分類號： S154.38+1 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0258-04

整個生態(tài)圈中，陸地和江河湖泊占據(jù)了大部分生態(tài)區(qū)域，而濕地作為二者的過渡地帶，其獨特的生態(tài)環(huán)境和生物群落分布使之備受關(guān)注，處于水、土交界的地帶存在著較強的生物生產(chǎn)力，對碳、氮等元素的轉(zhuǎn)化、循環(huán)起著重要的促進作用，成為地表元素運動的重要途徑之一[1-3]。微生物作為重要的生物群落之一，是濕地物質(zhì)能量交換、濕地生態(tài)的維系者，在促進濕地生態(tài)系統(tǒng)正常運轉(zhuǎn)方面起著不可忽視的作用[4]。微生物生長及作用的發(fā)揮受環(huán)境的影響較大，從群落結(jié)構(gòu)、生長狀況等研究微生物和環(huán)境之間的關(guān)系，可為濕地元素的轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)，也有利于對濕地的管理和合理開發(fā)利用[5-6]。近年來，分子生物學(xué)發(fā)展迅速，高通量測序技術(shù)因其低成本、無需克隆、通量高等獨特優(yōu)勢，在短時間內(nèi)可深入研究微生物的群落特征，甚至稀有物種的生長發(fā)育狀況[7-10]。

保持土壤肥力和活性是土壤保持生命活力的前提，而土壤微生物在肥力保持方面起著不可忽視的作用，不僅能夠使腐殖質(zhì)等迅速分解，轉(zhuǎn)化為土壤養(yǎng)分來源，而且能夠疏松土壤、增強土壤孔隙度等，對有機化合物的分解、碳氮循環(huán)等起著無可替代的作用，同時，能夠促進能量的轉(zhuǎn)化循環(huán)[11]。有研究表明，微生物作為土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，其多樣性和活性對土壤肥力起著重要的作用[12-13];細菌作為微生物群落的重要組成部分，占微生物類群的70%，且遺傳多樣性較為豐富，能促進土壤有機質(zhì)分解及大量營養(yǎng)物質(zhì)釋放，在碳、氮循環(huán)過程中起著重要的促進作用，參與整個物質(zhì)循環(huán)和能量交換[14-16]。

我國面積最大、生物多樣性明顯的淤泥質(zhì)濱海濕地為鹽城濱海濕地。20世紀80年代，江蘇人民在沿海進行大規(guī)模圍墾，全省近70%的圍墾集中在鹽城地區(qū)。隨著人為干預(yù)的增強，濱海濕地發(fā)生巨大變化，其土壤類型和物種多樣性也發(fā)生巨大變化[17]。李龍山等研究發(fā)現(xiàn)，濱海地區(qū)植物交替明顯，景觀呈現(xiàn)典型的動態(tài)變化，土壤覆被類型也在不斷變化[18]。但是，濕地微生物群落經(jīng)歷什么變化，這些變化與土壤之間關(guān)系怎樣，如何合理利用濱海濕地資源等等，有關(guān)這些研究相對較少。本研究從鹽城濱海濕地出發(fā)，探究微生物特點與土壤之間的關(guān)系，分析細菌多樣性對土壤帶來的影響、作用機制及其微生物群落的生長發(fā)育特點，為鹽城濱海濕地土壤資源的合理開發(fā)利用提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

江蘇省鹽城濱海濕地屬典型的季風(fēng)氣候特征，受到大陸氣候和海洋季風(fēng)的影響，具有較為獨特的氣候特點，年均降水量近1 000 mm，最冷月份在1月，平均氣溫約為3 ℃，最熱月集中在6—8月，平均氣溫達到30 ℃左右，9月至翌年2月并不寒冷。鹽城濱海濕地核心區(qū)地處新洋河和斗龍河過渡區(qū)，該區(qū)域受到人為的干擾并不明顯，依然保持較為完好的生態(tài)環(huán)境，呈現(xiàn)典型的濱海生態(tài)特點，具有差異明顯的分帶性，能從不同層次反映濕地的生態(tài)環(huán)境，從陸地向濱海延伸分布著蘆葦灘、堿蓬灘、互花米草灘，同時還因青蛤廣布而形成青蛤灘，對濕地研究具有很好的代表性。

1.2 土樣采集

于2016年11月2日枯水期，采用“S”形5點取樣法，分別從濱海濕地分層地帶采集0～10 cm土層的土壤，一部分用于測定土壤理化性狀，另一部分提取DNA用于測序。

1.3 測定內(nèi)容和方法

1.3.1 土壤理化性狀 分別采用氯化鉀溶液提取-分光光度法（HJ 634—2012）、堿熔-鉬銻抗分光光度法（HJ 632—2011）測定土壤總氮（TN）、總磷（TP）含量;采用氯化鉀溶液提取-分光光度法（HJ 634—2012）測定銨態(tài)氮（NH4+-N）、硝態(tài)氮（NO3--N）含量。

1.3.2 細菌16S rRNA基因測序 采用Omega試劑盒、引物F27提取16S rDNA宏基因組，采用ABI Gene Amp 9700型PCR儀進行擴增，試驗采用Trans Gen AP 221-02，20 μL反應(yīng)體系為：5×fast pfu buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 μmol/L 正反向引物各0.8 μL，F(xiàn)ast Pfu聚合酶0.4 μL，TemplateDNA 10 ng，加H2O至20 μL。反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)處理210 s; 55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27次循環(huán);72 ℃延伸 10 min。采用AxyPrep DNA凝膠回收，進行Tris_HCl洗脫處理，電泳檢測。采用Illumina MiseqPE 300平臺測序。

1.4 生物信息處理

對原始DNA通過Mothur軟件過濾處理，去除其中的嵌合體;以97%相似性為依據(jù)劃分可操作分類單元;通過稀釋性曲線分析獲取豐度、覆蓋度、多樣性指數(shù)，通過主成分分析獲取運算分類單元（OTU）相似性;采用貝葉斯算法，獲取不同分類水平上的樣品群落特點，整理OTU列表獲得分類信息與豐度，在門和綱分類水平下進行冗余分析（RDA），得到細菌群落組成結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 濱海濕地土壤理化指標(biāo)

由表1可知，濱海濕地土壤pH值在6.03～7.85之間，平均值為6.80，由蘆葦灘到青蛤灘，土壤pH值呈逐漸增加趨勢;土壤有機碳（SOC）含量在8.23～12.36 g/kg之間，平均值為10.11 g/kg，由蘆葦灘到青蛤灘，SOC呈逐漸降低趨勢;從蘆葦灘到青蛤灘，NH4+-N、NO3--N含量呈逐漸降低趨勢，在蘆葦灘出現(xiàn)最大值，分別為6.02、6.35 mg/kg，NH4+-N、NO3--N平均含量分別為5.30、3.38 mg/kg;TN含量變化趨勢與SOC相一致，從蘆葦灘到青蛤灘呈逐漸降低趨勢，其平均值為0.45 g/kg;TP含量變化趨勢不明顯，總體上呈遞減趨勢，其平均值為0.15 g/kg。

2.2 濱海濕地土壤細菌的多樣性

由表2可知，濱海濕地30個土壤樣品的高通量測序共得到50 172條高質(zhì)量序列，平均長度為8 362 bp，97%相似;各樣品文庫的覆蓋率為98.04%～99.56%，說明土樣中基因序列被檢出的概率相對較高，測序結(jié)果能夠代表濕地土壤細菌群落的真實情況。Chao1指數(shù)用于估算樣品中所含OTU總數(shù)，反映菌群豐度，Chao1指數(shù)越大，說明細菌群落豐度越高;Shannon指數(shù)反映細菌群落alpha多樣性指數(shù)，Shannon指數(shù)值越大，說明細菌群落多樣性越高。由表2可知，不同土壤細菌群落豐度指數(shù)與Shannon指數(shù)排序一致，為蘆葦灘>蘆葦堿蓬灘>堿蓬灘>堿蓬米草灘>互花米草灘>青蛤灘，從蘆葦灘到青蛤灘，土壤細菌Chao1、Ace、Shannon指數(shù)、OTU數(shù)量呈逐漸降低趨勢，土壤細菌覆蓋率、Simpson指數(shù)變化沒有明顯規(guī)律性變化。

2.3 濱海濕地土壤細菌門水平分類和綱水平分類

2.3.1 門分類水平 由圖1可知，沿湖面至坡地，土壤的門分類細菌相對豐度存在一定的變化趨勢，濱海濕地土壤相對豐度較高的細菌門為變形菌門、 放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門、綠菌門、硝化螺旋菌門，相對豐度值分別為27.26%～33.06%、23.47%～29.03%、15.03%～19.02%、7.13%～13.58%、5.13%～9.87%、2.16%～5.12%、1.54%～4.23%、0.66%～4.87%;由蘆葦灘到青蛤灘，變形菌門相對豐度大致呈先增大后減小趨勢，酸桿菌門大致呈增大趨勢，綠彎菌門大致呈先減小后增大趨勢，綠菌門沒有明顯變化規(guī)律。

2.3.2 綱分類水平 由圖2可知，濱海濕地土壤檢測到的主要綱有α-變形菌綱、放線菌綱、酸桿菌綱、β-變形菌綱、嗜熱油菌綱、芽單胞菌綱、桿菌綱、δ-變形菌綱，相對豐度值分別為26.06%～29.78%、18.30%～29.30%、15.02%～21.05%、8.26%～15.06%、5.32%～8.32%、3.12%～8.30%、1.45%～8.14%、1.21%～7.27%，其中，前6個綱在土壤中占主導(dǎo)地位，約占所有綱的80%。

2.4 濱海濕地土壤理化性質(zhì)與土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性

土壤可以提供細菌群落生長繁殖的微環(huán)境，而不同的植被類型可通過改變土壤的微環(huán)境間接影響土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的組成。由表3可知，變形菌門、酸桿菌門、厚壁菌門相對豐度與土壤pH值呈顯著負相關(guān)（P<0.05），綠彎菌門相對豐度與土壤pH值呈極顯著負相關(guān)（P<0.01）;變形菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門相對豐度與SOC含量呈顯著正相關(guān)，綠彎菌門相對豐度與土壤SOC含量呈極顯著正相關(guān);酸桿菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門相對豐度與NH4+-N含量呈顯著正相關(guān)，變形菌門、放線菌門相對豐度與NH4+-N含量呈極顯著正相關(guān);變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、綠菌門、綠菌門相對豐度與NO3--N含量呈顯著正相關(guān)，芽單胞菌門相對豐度與NO3--N含量呈極顯著正相關(guān);變形菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、綠菌門相對豐度與TN含量呈顯著正相關(guān)，芽單胞菌門相對豐度與TN含量呈極顯著正相關(guān);不同細菌門相對豐度與TP含量相關(guān)性不顯著（P>0.05）。

2.5 濱海濕地環(huán)境因素對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖3可知，對土壤理化環(huán)境因子與細菌主要菌落（門）所占比重進行中心標(biāo)準(zhǔn)化，并進行校正，提取第一、第二坐標(biāo)軸信息，對方差總解釋率分別為61.25%、23.58%;第一主軸上，SOC、NH4+-N含量是主要的影響因子，第二主軸上，SOC含量、pH值是主要的影響因子。因此，與濱海濕地土壤細菌群落相關(guān)性較大的土壤理化指標(biāo)為pH值、SOC含量、NH4+-N 含量。

3 結(jié)論與討論

生物的多樣性對維系整個生態(tài)平衡具有舉足輕重的作用，微生物群落的多樣性對促進整個生態(tài)循環(huán)同樣具有重要的意義，不僅有利于營養(yǎng)鹽的循環(huán)，且在有機物降解、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮著重要作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，蘆葦灘菌群的豐度、多樣性相對最高，其次是蘆葦堿蓬灘、堿蓬灘，而堿蓬米草灘、互花米草灘的豐度及多樣性并不明顯，而青蛤灘微菌群分布相對最少;土壤菌群的豐度、多樣性、OTU數(shù)量等從陸地向濱海地帶多呈遞降趨勢，這可能是距離河岸較遠的地方土壤肥力相對較強，對微生物的生長發(fā)育有利。對位置相對接近的地帶，其土壤菌群分布具有較明顯的相似性[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，微生物的生長發(fā)育及活動明顯受到水文狀況的制約，干濕交替對部分細菌生長具有明顯的促進作用，與淹沒區(qū)有顯著不同[21];水位狀況及其變化直接影響微生物群落的分布，且水文條件影響下的土壤沉積差異對微生物群落的影響更為顯著[22-23]。本研究結(jié)論與之較為吻合。

微生物菌群中的變形菌門在黃河三角洲濕地具有較高的豐度[24]。對鹽城濱海濕地而言，相對豐度較高的變形菌門α、β、δ-變形菌綱中，前2類菌綱具有較多的固氮細菌，能夠明顯提升土壤的固氮水平，對土壤肥力的保持具有重要作用，而δ-變形菌綱為食菌性細菌[25]，能夠明顯促進濕地養(yǎng)分循環(huán);酸桿菌門相對豐度值也較高，相對豐度值15.03%～19.02%，與張瓊瓊等的研究結(jié)果[26]基本一致，但其多為未培養(yǎng)細菌，雖然在土壤中廣泛存在，但相關(guān)研究并不多;試驗中菌群相對豐度位于第4位的綠彎菌門，以CO2為能量來源，在光合作用下獲取能量，進而使其能夠在SOC含量較低的土壤中擁有較強的生存能力和適應(yīng)性。通過冗余分析發(fā)現(xiàn)，SOC含量、NH4+-N含量、pH值對濕地菌群分布具有明顯的制約效應(yīng)。

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