谷胱甘肽調(diào)節(jié)水稻幼苗根系生長(zhǎng)的分子機(jī)制

崔桂彩 付童童 孫川惠

摘要：擬用中花11水稻（Oryza sativa L.）分析谷胱甘肽（glutathione，簡(jiǎn)稱(chēng)GSH）及其合成抑制劑丁硫氨酸-亞砜亞胺（buthionine sulfoximine，簡(jiǎn)稱(chēng)BSO）處理對(duì)水稻幼苗根系生長(zhǎng)及生長(zhǎng)素和細(xì)胞周期基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，在處理后5～9 d時(shí)，GSH促進(jìn)了水稻根系，特別是側(cè)根的形成和生長(zhǎng)，而B(niǎo)SO則顯著抑制了根系的生長(zhǎng)。對(duì)用GSH、BSO處理6 d時(shí)的DR5-GUS[GUS（β-glucuronidase）是β-葡萄糖苷酸酶]轉(zhuǎn)基因水稻（以中花11號(hào)為背景）分析發(fā)現(xiàn)，GSH加快了生長(zhǎng)素在根系的梯度分布，而B(niǎo)SO則延緩了生長(zhǎng)素的梯度分布，引起生長(zhǎng)素在初生根根尖的過(guò)度積累。從分子水平分析顯示，GSH、BSO處理后6 d時(shí)，水稻幼苗根系中分別有23個(gè)生長(zhǎng)素基因（如OsYUCCA7、OsPIN1c、OsARF1和OsIAA7等）和19個(gè)細(xì)胞周期基因（如Oryza;CycA3;1、Oryza;CycD4;2、Oryza;CDKC;2和Oryza;KRP;1等）的表達(dá)有明顯差異。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，GSH是調(diào)節(jié)水稻幼苗根系生長(zhǎng)的重要信號(hào)分子，它可能通過(guò)影響這些生長(zhǎng)素和細(xì)胞周期基因的表達(dá)及生長(zhǎng)素的分布而參與水稻根系生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)。

關(guān)鍵詞：谷胱甘肽;生長(zhǎng)素基因;水稻根系;細(xì)胞周期基因

中圖分類(lèi)號(hào)： S511.01 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）02-0069-04

谷胱甘肽（glutathione，簡(jiǎn)稱(chēng)GSH）是植物細(xì)胞內(nèi)的主要抗氧化劑和信號(hào)分子之一，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆過(guò)程中有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。研究表明，GSH可以促進(jìn)番茄再生根的形成，但是會(huì)抑制其伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，此外，GSH合成抑制劑丁硫氨酸-亞砜亞胺（buthionine sulfoximine，簡(jiǎn)稱(chēng)BSO）也會(huì)抑制再生根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，而對(duì)再生根的數(shù)量沒(méi)有明顯影響[2]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)素會(huì)明顯提高再生根中的GSH水平，從而抑制根的生長(zhǎng)，說(shuō)明在器官形成過(guò)程中生長(zhǎng)素和GSH之間存在一定的聯(lián)系。BSO阻滯擬南芥初生根的生長(zhǎng)，抑制其生長(zhǎng)素運(yùn)輸基因PIN1、PIN2、PIN7的表達(dá)和生長(zhǎng)素在根尖的積累[1]，但是對(duì)不定根的PIN1表達(dá)無(wú)影響。Cheng等的報(bào)道表明，增加GSH含量，會(huì)提高擬南芥對(duì)干旱和高鹽等逆境的抗性，激活生長(zhǎng)素合成基因（如YUC2）的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂相關(guān)基因的表達(dá)[3]。在擬南芥阻斷根生長(zhǎng)突變體rootmeristemless1中，GSH的合成強(qiáng)烈減少，該突變體的表型與BSO引起的生長(zhǎng)阻滯類(lèi)似[4]。GSH是維持?jǐn)M南芥根分生組織細(xì)胞分裂必需的信號(hào)分子，添加外源谷胱甘肽會(huì)促進(jìn)細(xì)胞分裂，相反，添加BSO會(huì)抑制細(xì)胞分裂[5]。在植物細(xì)胞早期分裂過(guò)程中，GSH和DNA共存于細(xì)胞核內(nèi)，從G1期到S期，GSH對(duì)維持核內(nèi)氧化還原狀態(tài)平衡和基因表達(dá)起著重要的調(diào)節(jié)作用[6]。GSH調(diào)節(jié)擬南芥細(xì)胞周期相關(guān)基因如RCK和SAP的表達(dá)[3]。這些研究表明，GSH在對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)與生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂之間有密切關(guān)系。本試驗(yàn)旨在通過(guò)分析GSH和BSO對(duì)水稻幼苗根系生長(zhǎng)、生長(zhǎng)素分布及生長(zhǎng)素和細(xì)胞周期基因表達(dá)的影響，探討GSH調(diào)節(jié)水稻幼苗根系生長(zhǎng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

采用中花11號(hào)水稻（Oryza sativa L.）種子（由山東理工大學(xué)植物逆境實(shí)驗(yàn)室保存），去殼后依次用75%乙醇（處理30 s）、0.1%氯化汞（處理15 min）、2%次氯酸鈉（處理20 min）消毒，再用滅菌水沖洗干凈。將種子分別植入含有 5 mmol/L GSH與 0.1 mmol/L 谷胱甘肽合成抑制劑BSO的MS培養(yǎng)基上，于 光—暗周期為14 h—10 h、光照度為 200 μmol/（m2·s）、晝—夜溫度周期為26 ℃—20 ℃、相對(duì)濕度約為50%～60%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)3～9 d后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。每個(gè)處理獨(dú)立重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)平行處理。

1.2 根系生長(zhǎng)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)

根系生長(zhǎng)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)包括所有根（初生根、不定根和側(cè)根）的數(shù)量和長(zhǎng)度，每個(gè)獨(dú)立重復(fù)至少統(tǒng)計(jì)20株，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用每株的平均值來(lái)表示。

1.3 根系生長(zhǎng)素分布的測(cè)定

將DR5-GUS轉(zhuǎn)基因水稻（以水稻中花11號(hào)為背景）種子滅菌消毒后，分別植入含有5 mmol/L GSH和0.1 mnol/L BSO的MS培養(yǎng)基上，在上述同樣條件下培養(yǎng)6 d，然后進(jìn)行GUS（β-glucuronidase，即β-葡萄糖苷酸酶）活性測(cè)定，分析根系生長(zhǎng)素的分布和積累變化[7]。每個(gè)處理至少設(shè)20株。

1.4 根系生長(zhǎng)素和細(xì)胞周期基因轉(zhuǎn)錄活性的分析

將中花11號(hào)水稻種子消毒后，分別植入含有5 mmol/L GSH和0.1 mmol/L BSO的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d（培養(yǎng)條件同“1.1”節(jié)），用TRIzol試劑提取總RNA，取1 μg RNA，用TaKaRa公司的RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0反轉(zhuǎn)錄為cDNA。所有處理用等量cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，以O(shè)sactin1基因作內(nèi)標(biāo)，采用Gel-Pro Analyzer軟件對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行半定量分析。將對(duì)照的轉(zhuǎn)錄活性設(shè)置為1，基因表達(dá)水平≥1.3為上調(diào)，≤0.7為下調(diào)。每種處理的PCR反應(yīng)在相同條件下獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，用單因素方差分析不同處理之間的差異，P<0.05 表示差異顯著。

1.6 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

本研究所有試驗(yàn)均于2015年9月至2017年3月進(jìn)行，在山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物分子生物學(xué)等相關(guān)實(shí)驗(yàn)室完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSH、BSO對(duì)水稻幼苗根系生長(zhǎng)的影響

2.1.1 GSH、BSO對(duì)水稻幼苗初生根長(zhǎng)度及其側(cè)根數(shù)量和長(zhǎng)度的影響 與對(duì)照組相比，水稻幼苗在處理后5～9 d期間，BSO顯著抑制了初生根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，而GSH則促進(jìn)了其生長(zhǎng)（圖1-A）。如試驗(yàn)后7 d時(shí)，BSO處理的初生根長(zhǎng)度比對(duì)照降低了49.7%（P<0.01），試驗(yàn)后5 d時(shí)，GSH處理的初生根長(zhǎng)度比對(duì)照增加了37.6%（P<0.01）。由圖1-B可見(jiàn)，GSH處理7～9 d時(shí)，初生根上側(cè)根的數(shù)量比對(duì)照顯著增加;相反，在相同的時(shí)間內(nèi)，BSO處理的初生根上的側(cè)根數(shù)量明顯比對(duì)照的少。如試驗(yàn)后9 d時(shí)，GSH處理的初生根上的側(cè)根數(shù)量比對(duì)照增加了32.6%（P<0.01），而B(niǎo)SO處理的初生根上的側(cè)根數(shù)量比對(duì)照減少了52.5%（P<0.01）。與對(duì)照相比，BSO極顯著抑制了初生根上側(cè)根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)（P<0.01），GSH則在一定程度上促進(jìn)了其生長(zhǎng)（圖1-C）。

2.1.2 GSH、BSO對(duì)水稻幼苗不定根數(shù)量和長(zhǎng)度的影響 由圖2可以看出，在試驗(yàn)后3～9 d期間，水稻幼苗不定根的數(shù)量（圖2-A）和長(zhǎng)度（圖2-B）有與圖1類(lèi)似的變化趨勢(shì)，其中BSO處理的不定根數(shù)量和長(zhǎng)度明顯不及對(duì)照。試驗(yàn)后9 d時(shí)，BSO處理的不定根的數(shù)量、長(zhǎng)度分別比對(duì)照減少了52.5%、52.6%，且與其他處理差異極顯著（P<0.01），但是GSH處理的不定根數(shù)量和長(zhǎng)度與對(duì)照之間差異不顯著。

2.1.3 GSH、BSO對(duì)水稻幼苗不定根上側(cè)根數(shù)量和長(zhǎng)度的影響 用GSH處理7～9 d時(shí)，水稻幼苗不定根上的側(cè)根數(shù)量（圖3-A）、長(zhǎng)度（圖3-B）都比對(duì)照的顯著增加。可見(jiàn)GSH加快了不定根上側(cè)根的形成和生長(zhǎng)。如GSH處理9 d時(shí)，不定根上側(cè)根的數(shù)量比對(duì)照的增加了3.4倍（P<0.01）。相反，在整個(gè)試驗(yàn)期間BSO處理完全抑制了水稻幼苗不定根上側(cè)根的形成（P<0.01）。

2.2 GSH、BSO對(duì)水稻幼苗根系生長(zhǎng)素積累和分布的影響

生長(zhǎng)素的積累和梯度分布對(duì)水稻幼苗根系的生長(zhǎng)和發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用。為進(jìn)一步了解 GSH、BSO處理對(duì)水稻根系生長(zhǎng)的影響與生長(zhǎng)素積累和分布之間的關(guān)系，本試驗(yàn)用DR5-GUS轉(zhuǎn)基因水稻分析了GSH、BSO處理6 d的根系生長(zhǎng)素變化。由圖4可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，GSH加快了生長(zhǎng)素在整個(gè)根系的梯度分布，減少了生長(zhǎng)素在初生根根尖的過(guò)度積累，促進(jìn)了側(cè)根的形成和發(fā)育。相反，BSO則延遲了生長(zhǎng)素的梯度分布，引起生長(zhǎng)素在根尖的過(guò)量積累，阻滯了側(cè)根的形成。

2.3 GSH、BSO對(duì)水稻幼苗根系生長(zhǎng)素基因表達(dá)的影響

生長(zhǎng)素在根系的積累和分布與生長(zhǎng)素信號(hào)途徑上關(guān)鍵基因家族OsYUCCAs（生長(zhǎng)素合成）、OsPINs（生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸）和OsARFs/OsIAAs（生長(zhǎng)素應(yīng)答）基因的表達(dá)有關(guān)。本試驗(yàn)比較分析了GSH、BSO處理6 d的水稻幼苗根系中62個(gè)生長(zhǎng)素基因表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，GSH、BSO處理引起表達(dá)變化的基因有23個(gè)（圖5），其中GSH處理后表達(dá)上調(diào)的基因有6個(gè)，分別是OsYUCCA7、OsPIN1c、OsPIN10b、OsARF7、OsARF8、OsARF25;BSO處理后表達(dá)上調(diào)的基因有15個(gè)，包括OsYUCCA3、OsYUCCA6、OsYUCCA7、OsPIN1a、OsARF1、OsARF2、OsARF6、OsARF19、OsARF21、OsIAA7、OsIAA17、OsIAA21、OsIAA23、OsIAA24和OsIAA27，表達(dá)下調(diào)的基因有6個(gè)，包括OsPIN1c、OsARF7、OsARF8、OsARF15、OsARF17和OsIAA19。以上結(jié)果表明，GSH、BSO處理對(duì)根系生長(zhǎng)素積累和分布的影響可能與生長(zhǎng)素基因的差異表達(dá)有密切關(guān)系。

2.4 GSH、BSO對(duì)水稻幼苗根系細(xì)胞周期基因表達(dá)的影響

細(xì)胞周期調(diào)控是控制水稻根系生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素之一。為進(jìn)一步分析GSH、BSO處理對(duì)根系生長(zhǎng)的影響與細(xì)胞周期之間的關(guān)系，本試驗(yàn)檢測(cè)了GSH、BSO處理6 d的水稻幼苗根系中56個(gè)細(xì)胞周期核心基因表達(dá)的變化情況。由圖6可見(jiàn)，與對(duì)照相比，GSH、BSO處理后有19個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了明顯變化，其中GSH激活表達(dá)的基因有6個(gè)，分別是Oryza;CycA2;1、Oryza;CycA3;1、Oryza;CycB2;1、Oryza;CycL1;1、Oryza;CDKC;2和Oryza;RB;1，抑制表達(dá)的基因也有6個(gè)，包括Orysa;CycB1;1、Oryza;CycD2;2、Oryza;CycD4;1、Oryza;CycD4;2、Oryza;CycD6;1和Oryza;CDKC;3。BSO上調(diào)表達(dá)的基因有4個(gè)，分別是Oryza;CycA3;2、Oryza;CycD6;1、Oryza;KRP;1和Oryza;RB;1，下調(diào)表達(dá)的基因有13個(gè)，包括Oryza;CycA2;1、Oryza;CycA3;1、Orysa;CycB1;1、Oryza;CycB1;2、Oryza;CycB2;1、Oryza;CycD2;2、Oryza;CycD7;1、Oryza;CycL1;1、Oryza;CDKA;1、Oryza;CDKB;2、Oryza;CDKC;2、Oryza;CDKC;3和Oryza;CDKF;3。值得注意的是，本試驗(yàn)中的BSO抑制了Oryza;CycA2;1等多數(shù)細(xì)胞周期進(jìn)程中的正調(diào)控基因的表達(dá)，而促進(jìn)了負(fù)調(diào)控基因Oryza;KRP;1、Oryza;RB;1的表達(dá)，因此BSO對(duì)水稻幼苗根系，特別是側(cè)根的形成和發(fā)育的抑制作用與其阻滯細(xì)胞分裂有很大關(guān)系。

3 討論

有研究表明，在根系形成過(guò)程中，生長(zhǎng)素和GSH之間存在一定聯(lián)系，適量的GSH有利于根系的生長(zhǎng)，而GSH含量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)抑制根的生長(zhǎng)[2]，BSO會(huì)抑制擬南芥初生根的生長(zhǎng)[1]。本試驗(yàn)得到類(lèi)似的結(jié)果，即GSH促進(jìn)了水稻幼苗特別是側(cè)根的形成和發(fā)育，而B(niǎo)SO則顯著抑制了初生根、不定根和側(cè)根的生長(zhǎng)。Koprivova等研究發(fā)現(xiàn)，BSO抑制生長(zhǎng)素運(yùn)輸基因PIN1、PIN2和PIN7的表達(dá)和生長(zhǎng)素在根尖的積累[1]。Cheng等報(bào)道，外源GSH激活了生長(zhǎng)素合成基因（如YUC2）的表達(dá)[3]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，GSH、BSO對(duì)生長(zhǎng)素信號(hào)途徑上某些關(guān)鍵基因（如OsYUCCA7、OsPIN1c、OsARF1和OsIAA7等）的表達(dá)調(diào)節(jié)存在明顯差異，它們可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)來(lái)影響生長(zhǎng)素在根系的梯度分布，進(jìn)而調(diào)控根系的生長(zhǎng)和發(fā)育。細(xì)胞周期是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵因素之一。GSH是維持?jǐn)M南芥根分生組織細(xì)胞分裂必需的信號(hào)分子。添加外源GSH可促進(jìn)細(xì)胞分裂，調(diào)節(jié)擬南芥細(xì)胞周期相關(guān)基因如（RCK和SAP）的表達(dá)[3]。相反，添加BSO會(huì)抑制細(xì)胞分裂[5]。在本試驗(yàn)中，在GSH、BSO處理?xiàng)l件下有19個(gè)細(xì)胞周期基因（如Oryza;CycA3;1、Oryza;CycD4;2、Oryza;CDKC;2和Oryza;KRP;1等）的表達(dá)差異顯著。特別值得注意的是，BSO抑制了多數(shù)細(xì)胞周期正調(diào)控基因如Oryza;CycA3;1的表達(dá)，而激活了負(fù)調(diào)控基因如Oryza;KRP;1的表達(dá)，推測(cè)BSO對(duì)根系生長(zhǎng)的抑制作用可能與其延緩細(xì)胞分裂進(jìn)程有密切關(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)果表明，GSH是調(diào)節(jié)水稻幼苗根系生長(zhǎng)的重要信號(hào)分子，它可能通過(guò)影響生長(zhǎng)素和細(xì)胞周期基因表達(dá)及生長(zhǎng)素分布而參與水稻根系生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)。

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