應(yīng)用計算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)對梅山豬公豬精子運(yùn)動特征的研究

郭蘋 吳慶 陳永霞

摘要：為定量檢測梅山豬公豬精子動態(tài)學(xué)參數(shù)，豐富梅山豬種質(zhì)特性研究基礎(chǔ)。采用計算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)對國家級梅山豬保種場6頭成年種公豬精液進(jìn)行實時檢測。結(jié)果顯示：梅山豬公豬精液中快速精子占74.69%，前向性運(yùn)動精子占61.45%，a級精子占47.30%;根據(jù)精子前向性運(yùn)動分級標(biāo)準(zhǔn)，梅山豬公豬精子曲線速度（VCL）、直線運(yùn)動速度（VSL）、平均路徑速度（VAP）、線性指數(shù)（LIN）、直線指數(shù)（STR）、頭部側(cè)向運(yùn)動平均振幅（ALH）、鞭打頻率（BCF）分別為（63.23±0.26） μm/s、（18.88±0.13） μm/s、（33.89±0.15） μm/s、29.86%、55.71%、（3.16±0.013） μm、（6.13±0.028） Hz;在運(yùn)動速度分級標(biāo)準(zhǔn)、世界衛(wèi)生組織（WHO）分級標(biāo)準(zhǔn)、前向運(yùn)動判斷標(biāo)準(zhǔn)這3種分類標(biāo)準(zhǔn)中，除LIN、STR和振動指數(shù)（WOB），上述其他指標(biāo)均呈極顯著差異（P<0.01）。研究首次及時準(zhǔn)確地定量分析了梅山豬公豬精子的動態(tài)學(xué)參數(shù)，豐富了梅山豬的研究素材。

關(guān)鍵詞：梅山豬;CASA系統(tǒng);精子活力;VCL;STR

中圖分類號： S828.8+13 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0165-04

梅山豬是我國著名的地方品種，以高繁殖力而為世人熟知，曾先后出口日本、法國、美國等國家，為世界種豬育種作出巨大貢獻(xiàn)[1]。為此，國內(nèi)外許多科技工作者對梅山豬獨特的生殖生理特性進(jìn)行了大量的研究報道，無論是在細(xì)胞水平還是分子水平，認(rèn)為梅山豬高繁殖力可能與母豬排卵數(shù)、胚胎死亡率、激素水平、子宮容積、耐低營養(yǎng)水平、基因多態(tài)性等因素有關(guān)[2-5]。但這些因素?zé)o疑都是從母本角度考慮，而關(guān)于父本方面的研究[6]少之又少，相比于人類男性的研究，一方面是由于公豬的飼養(yǎng)數(shù)量少、飼養(yǎng)成本高、淘汰率高、更新快等，另一方面是由于傳統(tǒng)的精液品質(zhì)檢查存在檢測時間長、準(zhǔn)確性不高、檢測指標(biāo)少等問題[7]。隨著計算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展，計算機(jī)輔助精液分析技術(shù)（CASA）也越來越普及，特別是在人類精液質(zhì)量分析檢測中[8-11]，CASA系統(tǒng)可對公豬精液品質(zhì)進(jìn)行快速、客觀的分析[12]。

本研究利用CASA系統(tǒng)，以梅山豬公豬為研究對象，檢測梅山豬公豬精子運(yùn)動參數(shù)，定量分析梅山豬公豬精子活力、運(yùn)動能力和運(yùn)動方式等，以期進(jìn)一步豐富梅山豬種質(zhì)特性的研究素材，為梅山豬高繁殖力生理機(jī)制的研究奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗的梅山種公豬均來自江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院國家級梅山豬種豬場，共6頭成年種公豬（28～38月齡），每頭種公豬每周采精2次，固定采精時間和采精員，所有公豬的營養(yǎng)水平、日糧配方、管理方式、環(huán)境條件等都相同。試驗時間：2016年11月至2017年7月。試驗地點：江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院種豬場實驗室。

1.2 精液采集和指標(biāo)測定

公豬精液的采集用手握法進(jìn)行;在采精過程中，棄去前、后段精清，收集中段富含精子的部分，用4層滅菌紗布過濾精液，采完精后，立即吸取10 μL精液，放入2 μL計數(shù)池（標(biāo)準(zhǔn)計數(shù)板，8個計數(shù)池。每個計數(shù)池容積22 μL，池高20 μm），置于負(fù)相差顯微鏡（放大倍數(shù)為100）倍下進(jìn)行觀察和檢測。

采用西班牙CASA系統(tǒng)進(jìn)行精液質(zhì)量分析。測定的主要精子運(yùn)動指標(biāo)如下[13]：

VCL（curvilinear velocity，即曲線速度），是精子頭沿其實際行走曲線的運(yùn)動速度，μm/s。

VSL[straight-line （rectilinear） velocity，即直線運(yùn)動速度]，是精子頭從開始檢測時的位置至最后所處位置之間的直線運(yùn)動的平均速度，μm/s。

VAP（average path velocity，即平均路徑速度），是精子頭沿其空間平均軌跡的運(yùn)動速度，μm/s。這種速度是計算機(jī)CASA儀器中的算法將精子運(yùn)動的實際軌跡平均后計算得出的。

LIN（linearity，即線性指數(shù)或線性度），是精子運(yùn)動曲線的直線分離度，計算公式為LIN=VSL/VCL×100%。

STR（straightness，即直線指數(shù)），或前向性，是精子運(yùn)動平均路徑的直線分離度，計算公式為STR=VSL/VAP×100%。

WOB（wobble，即振動指數(shù)），是精子頭沿其實際軌跡的空間平均路徑擺動的尺度，計算公式為WOB=VAP/VCL×100%。

ALH（amplitude of lateral head displacement，即頭部側(cè)向運(yùn)動平均振幅），是精子頭部實際運(yùn)動軌跡對平均路徑的側(cè)擺幅度，μm。

BCF（beat-cross frequency，即鞭打頻率），是精子頭部跨越其平均路徑的頻率，Hz。

檢測時，要求精子總數(shù)不低于500個。

1.3 豬的精子分級判斷標(biāo)準(zhǔn)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計

1.3.1 運(yùn)動速度分級標(biāo)準(zhǔn) 快速，VCL≥45 μm/s;中速，25 μm/s≤VCL<45 μm/s;慢速，10 μm/s

1.3.2 世界衛(wèi)生組織（WHO）分級標(biāo)準(zhǔn) a級，VCL≥45 μm/s，且STR≥45%;b級，VCL≥45 μm/s，且STR<45%;或VCL≥25 μm/s，且STR≥45%;c級，VCL≥25 μm/s，且STR<45%;或VCL>10 μm/s;d級，VCL≤10 μm/s。

1.3.3 前向運(yùn)動判斷標(biāo)準(zhǔn) VCL≥25 μm/s，且STR≥45%，判為前向運(yùn)動，否則為非前向運(yùn)動。

1.3.4 超級精子（hyperactive） 判斷標(biāo)準(zhǔn)為ALH>2.5 μm，且 STR>85%。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 梅山豬公豬精子分級

按照精子運(yùn)動速度分級，可分為快速、中速、慢速和不動，梅山豬公豬8 969個精子中，快速精子數(shù)量為6 699個，比例為74.69%，中速的為1 824個，占20.34%，慢速的為427個，占4.76%。根據(jù)精子前向性運(yùn)動分級標(biāo)準(zhǔn)，可分為前向性運(yùn)動、非前向性運(yùn)動和不動精子，梅山豬公豬前向運(yùn)動的精子數(shù)量為5 511個，比例為61.45%，非前向運(yùn)動的有3 439個，比例為 38.34%。根據(jù)WHO分級標(biāo)準(zhǔn)，分為a、b、c、d級4個級別，a級要求最高，梅山豬公豬中a級精子數(shù)量為4 242個，占 47.30%，b級占41.54%（表1、圖1、圖2、圖3）。梅山豬公豬 8 969 個精子中，超級精子344個，占3.84%。

2.2 梅山豬公豬精子運(yùn)動速度分級的運(yùn)動參數(shù)

梅山豬公豬精子運(yùn)動速度分級的參數(shù)平均值如表2所示。梅山豬公豬精子運(yùn)動速度分級是依據(jù)VCL而分的，其他指標(biāo)結(jié)果如下：在VSL方面，快速組平均值最高，為（21.50±0.16） μm/s，最高值為89.00 μm/s，慢速組最低，僅為（6.39±0.22） μm/s，差異極顯著（P<0.01）;在VAP方面，快速組平均值最高，為（39.20±0.15） μm/s，最高值為 101.80 μm/s，慢速組最低，僅為（10.53±0.21） μm/s，差異極顯著（P<0.01）;在LIN、STR和WOB方面，均表現(xiàn)為中速組最高，快速組和慢速組隨機(jī)波動;在ALH和BCF方面，表現(xiàn)為快速組>中速組>慢速組，且不同組間差異極顯著（P<0.01）。

2.3 梅山豬公豬精子WHO分級的運(yùn)動參數(shù)

由表3可知，梅山豬公豬精子按照WHO分類標(biāo)準(zhǔn)，在VCL方面，a級平均值最高，為（72.77±0.30） μm/s，c級最低，為（28.97±0.30） μm/s;在VSL方面，a級平均值最高，為（27.77±0.18） μm/s，c級最低，為（5.54±0.12） μm/s;在VAP方面，a級平均值最高，為（40.53±0.19） μm/s，c級最低，為（14.19±0.19） μm/s。以上三者均表現(xiàn)出相同趨勢：a級>b級>c級，且差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。在LIN、STR和WOB方面， 均表現(xiàn)為a級最高， b級和c級隨機(jī)波動。在ALH和BCF方面，與VCL、VSL和VAP表現(xiàn)出相同的趨勢，各組間差異極顯著（P<0.01）。

2.4 梅山豬公豬精子前向性運(yùn)動參數(shù)

由表4可知，梅山豬公豬精子平均VCL為（63.23±0.26） μm/s，最高為175.60 μm/s，平均VSL為（18.88±0.13） μm/s，最高為89.00 μm/s，平均LIN為29.86%，平均STR為 55.71%，平均ALH為（3.16±0.013） μm，最高為10.30 μm，平均BCF為（6.13±0.028） Hz。前向性運(yùn)動精子中，平均VCL為（64.19±0.31） μm/s，平均VSL為（24.91±0.16） μm/s，平均VAP為（36.06±0.19） μm/s，平均LIN為38.81%，平均STR為69.08%，平均WOB為56.18%。前向運(yùn)動和非前向運(yùn)動2組間，除未對LIN、STR和WOB指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗外，其他指標(biāo)間差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。

3 討論

3.1 關(guān)于CASA系統(tǒng)

傳統(tǒng)的精液品質(zhì)檢測和評價方法是人工分析法，是按照GB 23238—2009《種豬常溫精液》和GB/T 25172—2010《豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范》對豬常溫精液檢測的各項指標(biāo)作出評價。人工分析法常受實驗室條件、檢測人員技術(shù)水平和經(jīng)驗的制約，具有主觀性強(qiáng)、準(zhǔn)確性差、速度慢等缺陷，且檢測過程費(fèi)時費(fèi)力[7]。但隨著CASA系統(tǒng)的出現(xiàn)和應(yīng)用，精子活力、密度等參數(shù)能被更加準(zhǔn)確及時的定量分析。

CASA系統(tǒng)采用計算機(jī)技術(shù)和先進(jìn)的圖像處理技術(shù)，利用相差顯微鏡識別和捕捉精子，一般是識別精子頭，記錄精子形態(tài)和運(yùn)動軌跡，模擬計算精子的形態(tài)學(xué)參數(shù)和動態(tài)學(xué)參數(shù)，根據(jù)各種動物的參數(shù)設(shè)置，自動完成數(shù)據(jù)的整理和分析[14-17]，因此，CASA系統(tǒng)更能客觀地定量測定精子活力、畸形率、精子密度等指標(biāo)。目前，CASA系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于人類男性不育患者精子活力檢測中，在大鼠、小鼠、雞、鵝、豬、牛、魚等中也有應(yīng)用[7，12，15-17]。在人類精子活力檢測中，利用正相差顯微鏡識別和捕捉精子，而豬和其他動物則是利用負(fù)相差顯微鏡。

3.2 關(guān)于參數(shù)設(shè)置

不同的動物具有不同的速度分級標(biāo)準(zhǔn)?？梢愿鶕?jù)VCL和VAP進(jìn)行分級，但因為VAP是計算機(jī)將精子運(yùn)動的實際軌跡平均后計算出來的，可因不同型號的儀器而有所改變，所以，一般而言，大多數(shù)動物采用VCL分級，VCL分級的最低閾值為10 μm/s，低于10 μm/s均判為不動。因為不同的動物精子運(yùn)動速率存在一定差異性，那么快速、中速、慢速和不動的閾值不同的動物是不一致的。如對于人的快速與中速、中速與慢速的閾值分別為35、15 μm/s[13]，公牛為50、25 μm/s，公羊為75、45 μm/s，狗為100、65 μm/s，馬為90、45 μm/s，嚙齒類為45、15 μm/s，魚為100、45 μm/s，雞為100、50 μm/s。本試驗中，豬的閾值分別為45、25 μm/s。

在WHO分級方面，是根據(jù)VCL和STR進(jìn)行的，分為a級、b級、c級和d級，不同動物的WHO分級標(biāo)準(zhǔn)是參照各個物種的速度分級標(biāo)準(zhǔn)中的VCL閾值和前向性運(yùn)動分級標(biāo)準(zhǔn)中的STR閾值而定的。

在前進(jìn)性運(yùn)動分級方面，只存在快速前向運(yùn)動和中速前向運(yùn)動，判斷標(biāo)準(zhǔn)在不同動物中也是不一致的，人的 STR≥80%[13]，公牛的STR≥70%，公羊的STR≥80%，狗的STR≥75%，馬的STR≥75%，嚙齒類的STR≥50%，魚的 STR≥80%，雞的STR≥70%。本試驗中，豬的STR≥45%。

3.3 關(guān)于3種評價標(biāo)準(zhǔn)

運(yùn)動能力是精子獨有的特征，不僅能夠直觀地反映精子質(zhì)量，還能夠間接地反映精子的受精能力[17-18]。運(yùn)動能力包括運(yùn)動速度和運(yùn)動方式[17]。速度標(biāo)準(zhǔn)中注重精子的運(yùn)動速度，忽略了精子的運(yùn)動方式，并不能反映精子的有效運(yùn)動或真實的遷移力;而在前向運(yùn)動分級標(biāo)準(zhǔn)和WHO分級標(biāo)準(zhǔn)中，既注重精子運(yùn)動速度，又能保證精子運(yùn)動的直線性，這樣才能保證少數(shù)精子穿過生殖道柵欄到達(dá)受精部位，等待卵子，并需要穿透卵丘和透明帶完成受精過程[19]。

在運(yùn)動速度分級標(biāo)準(zhǔn)、前向運(yùn)動判斷標(biāo)準(zhǔn)、WHO分級標(biāo)準(zhǔn)三者之間的關(guān)系方面，速度標(biāo)準(zhǔn)中的“快速”包括快速前向運(yùn)動和快速非前向運(yùn)動類型（前向運(yùn)動分級），快速前向運(yùn)動評為a級，快速非前向運(yùn)動評為b級;“中速”包括中速前向運(yùn)動和中速非前向運(yùn)動，中速前向運(yùn)動評為b級，中速非前向運(yùn)動評為c級;“慢速”均為慢速非前向運(yùn)動或c級;“不動”均為d級?？焖偾跋蜻\(yùn)動和中速前向運(yùn)動均為前向運(yùn)動，快速非前向運(yùn)動、中速非前向運(yùn)動和慢速非前向運(yùn)動均為非前向運(yùn)動。速度標(biāo)準(zhǔn)中的“不動”、前進(jìn)運(yùn)動標(biāo)準(zhǔn)中的“不動”和WHO分級標(biāo)準(zhǔn)中的“d級”是一致的。

在上述3種評價標(biāo)準(zhǔn)中，許多研究實踐表明，前進(jìn)性運(yùn)動分級標(biāo)準(zhǔn)更能客觀地反映精子的運(yùn)動速度和運(yùn)動方式，是評價精子活力和受精率的一個重要體系[9-11，14，17]。

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