鏈霉菌B221與地衣芽孢桿菌NJU-1411-1固體發(fā)酵廢棄羊毛角蛋白工藝優(yōu)化和工業(yè)化產(chǎn)品分析

權金盼 李玉妹 龍宏艷

摘要：采用地衣芽胞桿菌NJU-1411-1和鏈霉菌B221，通過固體發(fā)酵降解羊毛角蛋白，研究培養(yǎng)基含水量、培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵周期等發(fā)酵條件的優(yōu)化。結果表明，2株菌的最佳固體發(fā)酵工藝條件相同，培養(yǎng)基起始含水量為15 mL/10 g羊毛粉，培養(yǎng)基最佳起始pH值為8～9，最適發(fā)酵溫度為40 ℃，發(fā)酵周期為5 d。工業(yè)化發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸含量、體外消化率、動物消化率等方面研究結果表明，發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸含量為52.34%;發(fā)酵后體外消化率由67.44%提高至82.20%;動物體內(nèi)消化率達到85.43%。這些結果表明發(fā)酵角蛋白產(chǎn)品作為飼料蛋白添加劑完全可行，可用于替代或部分替代魚粉、豆粕等蛋白飼料原料。

關鍵詞：羊毛角蛋白;微生物降解;固體發(fā)酵;工藝優(yōu)化;工業(yè)化產(chǎn)品;動物消化率

中圖分類號： S182;X172 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0153-04

在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，大規(guī)模的畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)生了大量廢棄物，其中包括動物的毛發(fā)、蹄、羽毛等。這些廢棄物富含角蛋白，粗蛋白含量高達80%以上，含有豐富的蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、胱氨酸等氨基酸，還含有常量元素、微量元素及未知生長因子[1]。角蛋白中所含的胱氨酸更是天然蛋白飼料之冠，可以滿足一部分動物對胱氨酸的需要，是一種良好的、可替代或部分替代魚粉的飼料蛋白來源，對它的開發(fā)利用具有重要應用前景：一方面可以解決當前飼料工業(yè)中蛋白資源不足;另一方面又可解決環(huán)境污染問題。

對角蛋白資源的開發(fā)利用歷來為人們所關注。傳統(tǒng)方法主要是利用物理和化學方法將其降解，目前在國內(nèi)最常用的技術有高溫水解法和膨化法，而國外則主要采用高溫水解法。但這些方法存在能耗高、環(huán)境污染嚴重、經(jīng)濟效益不高等問題，同時對氨基酸組成改善也很有限，Wang等認為，水解處理可在一定程度上提高羽毛粉的消化率，但也使一部分必需氨基酸如賴氨酸、蛋氨酸和色氨酸丟失，并引發(fā)一些非營養(yǎng)價值氨基酸的形成[2-3]。由于傳統(tǒng)方法存在許多不足，利用生物技術途徑來解決羽毛角蛋白的分解利用越來越受到關注。其主要優(yōu)點有：（1）微生物和角蛋白酶可作用于角蛋白改變其結構，從而降低它對動物消化酶的抗性。（2）處理過程中產(chǎn)生的菌體蛋白可以加強角蛋白產(chǎn)品的營養(yǎng)價值。用微生物處理過的角蛋白產(chǎn)品中賴氨酸、蛋氨酸和精氨酸含量比未處理要高，這說明不僅角蛋白可以作為蛋白來源，微生物菌體也可有同樣的效果。（3）對環(huán)境友好，有利于在無污染條件下發(fā)展畜牧業(yè)。

筆者所在實驗室長期致力于羽毛角蛋白的生物技術利用途徑研究，取得了相關研究進展[4-6];同時在與企業(yè)合作過程中，發(fā)現(xiàn)羊毛廢棄物的生物技術利用途徑開發(fā)值得關注。本研究以羊毛廢棄物為原料，開展了角蛋白降解菌固體發(fā)酵羊毛廢棄物的工藝優(yōu)化，并與江蘇省農(nóng)業(yè)科學院合作，對獲得的工業(yè)化發(fā)酵產(chǎn)品進行了氨基酸含量、可溶性蛋白質含量、體外消化率、動物消化率等方面的性質研究，旨在為利用生物技術方法開發(fā)利用羊毛廢棄物角蛋白資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

鏈霉菌B221、地衣芽孢桿菌NJU-1411-1，均從畜禽場長年堆積角蛋白廢棄物的土壤中經(jīng)過富集培養(yǎng)和分離篩選獲得。

基礎培養(yǎng)基（BM）：按文獻[6]所述方法配制。

發(fā)酵培養(yǎng)基：不同體積的基本培養(yǎng)基中，加入10 g羊毛粉。

1.2 試驗方法

1.2.1 羊毛角蛋白的固體發(fā)酵工藝流程

1.2.2 羊毛角蛋白固體發(fā)酵主要參數(shù) （1）培養(yǎng)基起始含水量：10 g羊毛粉中加入BM體積分別為9、12、15、18 mL，固定發(fā)酵溫度為40 ℃，培養(yǎng)基起始pH值為9.0。（2）發(fā)酵溫度：發(fā)酵溫度分別為20、30、40、50 ℃，固定10 g羊毛中加入BM體積為15 mL，培養(yǎng)基起始pH值為9.0。（3）培養(yǎng)基起始pH值：培養(yǎng)基起始pH值分別為6、7、8、9和10，固定發(fā)酵溫度為40 ℃，10 g羊毛中加入BM體積為15 mL。（4）發(fā)酵周期：在上述發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化條件下進行固體發(fā)酵，每隔24 h取樣1次，測定角蛋白酶活性、可溶性蛋白質含量和水溶性物質含量。

工業(yè)化產(chǎn)品在山東合作廠家采用自制的4 t固體發(fā)酵罐完成，共獲得發(fā)酵產(chǎn)品30 t。

1.3 測定方法

1.3.1 角蛋白酶活性、可溶性蛋白質含量和水溶性物質含量 按文獻[6]所述方法進行測定。

1.3.2 工業(yè)化產(chǎn)品分析

1.3.2.1 氨基酸含量測定 將發(fā)酵羊毛粉用鹽酸處理得到氨基酸水解液，然后用高效液相色譜檢測。

1.3.2.2 體外消化率的測定 參照文獻[7]所述方法進行。

1.3.2.3 動物消化率的測定 （1）試驗設計。選取90 kg左右健康蘇鐘豬公豬6頭，分2次試驗，第1次試驗飼喂1號日糧，預飼期6 d，試驗期4 d;第2次試驗飼喂2號日糧，預飼期6 d，試驗期4 d。豬只個體單籠飼養(yǎng)，每日早8：00、晚16：00時加料，進行定量飼喂，試驗結束統(tǒng)計每頭豬采食量。（2）試驗日糧。1號日糧：參照NRC（1998）豬營養(yǎng)需要配制，豆粕含量為18%。2號日糧：采用發(fā)酵產(chǎn)品替換1號日糧中的豆粕、豆油等組分，添加量約為20%。（3）糞尿樣收集。全天 24 h 及時全量收集糞、尿，記錄糞質量及尿液體積，并進行烘干處理。每天收集的鮮糞按四分法縮減至約500 g，加入濃度為10%的硫酸溶液50 mL，于65 ℃下烘干48 h，取出裝入自封袋保存?zhèn)溆谩Ｄ驑佑昧客卜Q量并記錄每頭豬每天的全部產(chǎn)尿量。按原尿體積的10%取樣，并按尿樣體積的5%加入10%濃硫酸固氮，最后將5 d的尿液混勻備用。試驗結束后稱樣品總質量，將所收集的每頭豬風干糞樣粉碎均勻混合，按四分法縮減至約100 g，粉碎，全部通過1 mm尼龍篩，裝入樣品瓶中，備用。將每頭供試豬收集的尿樣分別置于玻璃容器中，混合均勻后取其中200 mL樣品備用。（4）蛋白質的表觀消化率的測定。用凱氏定氮法測定飼料和糞、尿中粗蛋白的含量，具體方法參考文獻[8]。按下式計算蛋白質表觀消化率：

蛋白質表觀消化率=（食入料質量×料中蛋白質含量-糞質量×糞中蛋白質含量）/食入料質量×料中蛋白質含量×100%。

2 結果與分析

2.1 羊毛固體發(fā)酵過程中產(chǎn)物形態(tài)變化

對羊毛的微生物降解產(chǎn)物進行觀察發(fā)現(xiàn)，羊毛形態(tài)變化明顯，如圖1所示。未接菌種的CK組幾乎沒有變化（圖1-C），而接菌的羊毛發(fā)酵物顏色發(fā)黑，體積減少，有明顯的液化現(xiàn)象（圖1-A、圖1-B）。

2.2 主要發(fā)酵參數(shù)對羊毛固體發(fā)酵過程的影響

2.2.1 培養(yǎng)基起始含水量對固體發(fā)酵的影響 固體發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基含水量是非常重要的參數(shù)，是決定固體發(fā)酵能否成功的關鍵因素之一[9]。水活度與物料的含水量密切相關，對于微生物而言，過高的含水量會降低溶氧，從而抑制生長;過低的含水量則不能滿足生長的需求。在固體發(fā)酵過程中，包被在固體基質表面的水膜溶解了微生物需要的無機鹽和代謝產(chǎn)物，同時為微生物的生長提供了所需的潮濕環(huán)境。另外，基質含水量還影響著培養(yǎng)系統(tǒng)中的氧氣供應、氣體流動等，是關系到發(fā)酵成敗的主要制約因素。從圖2可以看出，對于B221和NJU-1411-1，當培養(yǎng)基起始含水量為15 mL/10 g羊毛粉時，角蛋白酶酶活性、固體發(fā)酵產(chǎn)物水溶性物質含量和可溶性蛋白質含量最高。當加入的BM培養(yǎng)液為9 mL或 18 mL 時，酶活性、水溶性物質含量和可溶性蛋白質含量較低，可能是因為含水量過低時，生物熱及通風造成水分損失，微生物生長受到限制，直接影響終產(chǎn)物的產(chǎn)量;當培養(yǎng)基含水量過高時，培養(yǎng)基有效孔隙變少，使得氧氣供應不足。因而培養(yǎng)基含水量過高或過低均不利于固體發(fā)酵的順利進行。目前尚無理想的理論模型來預測固體發(fā)酵的最佳含水量，必須通過試驗來確定。

2.2.2 培養(yǎng)基起始pH值對固體發(fā)酵的影響 pH值也是影響微生物生長代謝的重要因素之一，但由于固態(tài)物料的含水量偏低，常見液態(tài)發(fā)酵中的pH值檢測手段難以應用，所以固體發(fā)酵時通常把初始pH值調(diào)到所需要的數(shù)值，發(fā)酵過程一般不再檢測和控制。從圖3可以看出，當pH值為9時，B221和NJU-1411-1的角蛋白酶活達到最大;pH值為8時，發(fā)酵物中可溶性蛋白質含量和水溶性物質含量為最大，但與pH值為9時差異不大。在相同pH值條件下，NJU-1411-1的發(fā)酵物可溶性蛋白質含量比B221的高，pH值為8時NJU-1411-1的發(fā)酵物可溶性蛋白質含量為39.17%，B221則為28.77%;所以若從提高產(chǎn)物可溶性蛋白質含量的角度出發(fā)，NJU-1411-1更適合于羊毛角蛋白的固體發(fā)酵生產(chǎn)。

2.2.3 發(fā)酵溫度對固體發(fā)酵的影響 溫度是影響微生物生長的重要因素，溫度會影響酶的活性，促進或抑制一些特殊代謝產(chǎn)物的生成，溫度過高甚至導致細胞死亡，從而直接關系到發(fā)酵過程的正常進行以及最終產(chǎn)品的生成。由圖4可以看出，當溫度為20 ℃時，角蛋白酶活、發(fā)酵產(chǎn)物中水溶性物質和可溶性蛋白質含量均較低，微生物對角蛋白的降解也很微弱;隨著溫度的升高，水溶性物質和可溶性蛋白質含量迅速增加，溫度為40 ℃達到最高，這說明B221和NJU-1411-1產(chǎn)生的角蛋白酶耐熱，最適發(fā)酵溫度為40 ℃。從溫度實驗結果分析，B221和NJU-1411-1都具有一定的耐熱性，這為以后進一步進行工業(yè)化生產(chǎn)和實際應用奠定了良好基礎。

2.2.3 發(fā)酵周期的確定 根據(jù)上述固體發(fā)酵參數(shù)的研究結

果，對于B221和NJU-1411-1，均在250 mL三角瓶加入羊毛粉10 g、 BM培養(yǎng)基15 mL， 在培養(yǎng)基初始pH值為8、 培養(yǎng)溫度為40 ℃培養(yǎng)的發(fā)酵條件下進行發(fā)酵周期研究。研究結果表明，發(fā)酵3 d時角蛋白酶活性達到最大值，NJU-1411-1為24.67 U/mL，B221為7.61 U/mL;隨著發(fā)酵時間延長，角蛋白酶活性逐步降低，可能是因為3 d以后微生物的生長進入衰落期，角蛋白酶的分泌減少;發(fā)酵前5 d，水溶性物質和可溶性蛋白質含量都在不斷提高，但5 d之后趨于平緩，B221從第5天到第6天可溶性蛋白質含量只提高了2.07%，而NJU-1411-1甚至有所降低。因此從提高可溶性蛋白質含量的目的出發(fā)，確定發(fā)酵周期為5 d。

2.3 工業(yè)化產(chǎn)品的可行性分析

根據(jù)以上發(fā)酵參數(shù)，在山東稍門骨粉廠，于2014年6—9月完成了產(chǎn)品發(fā)酵，并對獲得的產(chǎn)品開展了產(chǎn)品性質分析，進一步證明了發(fā)酵產(chǎn)品具有良好的替代或半替代魚粉等蛋白資源的可能性。

2.3.1 發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸組成 發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸含量為52.34%，較原料有所下降，這可能是因為在發(fā)酵過程中，角蛋白大分子不僅被降解為小肽或氨基酸，還可進一步分解為氨氣或其他含氮氣體并揮發(fā)掉，實際生產(chǎn)過程中也在發(fā)酵罐里可以聞到很重的氨味，所以羽毛粉的氨基酸總量會減少。從氨基酸組成來看，兩者沒有明顯差異。

2.3.2 發(fā)酵產(chǎn)品的體外消化率 經(jīng)過發(fā)酵后體外消化率由67.44%提高至82.20%，這可能是因為通過發(fā)酵，角蛋白大分子被降解成為了一些小肽和氨基酸分子，提高了可溶性蛋白質含量，從而有助于角蛋白的消化。張洋采用地衣芽孢桿菌FBK-1進行角蛋白液體發(fā)酵產(chǎn)生角蛋白酶粗酶液，并研究了粗酶液的性質，發(fā)現(xiàn)羽毛粉加入角蛋白酶粗酶液，并在 121 ℃ 處理1 h后羽毛粉的胃酶消化率為78%，消化率提高不是很明顯[11];李寶林等通過對羽毛粉高溫高壓水解法與酶解法的研究，表明高溫高壓水解法體外消化率為32.92%，酶解法體外消化率為66.33%;然后用肉仔雞對酶解羽毛粉氨基酸表觀消化率進行測定，結果為77.02%[12]。本試驗采用微生物固體發(fā)酵，產(chǎn)品的體外消化率有了較大提高?？梢酝茰y，在利用角蛋白資源方面，微生物發(fā)酵方法與純粹的角蛋白酶降解法相比，不僅節(jié)約成本，而且產(chǎn)品的性質也可以有更好的改善和提高。

2.3.3 發(fā)酵產(chǎn)品的動物消化率 試驗結果表明，發(fā)酵產(chǎn)品的動物體內(nèi)消化率為85.43%。李曉燕等研究了酶解羽毛粉替代日糧魚粉對生長豬蛋白質消化率的影響，對照組采用3%進口魚粉添加日糧，處理Ⅰ、處理Ⅱ分別用酶解羽毛粉按50%、100%蛋白比例替代對照組日糧中含等量蛋白質的魚粉，結果表明對照組蛋白消化率為76.50%，處理Ⅰ和處理Ⅱ分別為75.83%和74.68%，處理Ⅰ和處理Ⅱ蛋白質消化率與對照組相比均下降，但各組間差異不顯著[13]。在本試驗中，豬日糧的發(fā)酵羽毛粉添加量較大（為飼料總量的20%），雖然對飼料適口性有一定影響，但在豬體內(nèi)的蛋白消化率依然能保持在較高水平，達到85.43%，這為產(chǎn)品的規(guī)?；a(chǎn)和應用奠定了良好的基礎。3 結論

對于地衣芽胞桿菌NJU-1411-1和鏈霉菌B221，羊毛角蛋白最佳固體發(fā)酵工藝條件基本相同，培養(yǎng)基起始含水量為15 mL/10 g羊毛粉;培養(yǎng)基最佳起始pH值為8 ～ 9;最適發(fā)酵溫度為40 ℃;發(fā)酵周期為5 d。

本研究檢測了發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸含量、體外消化率和動物體內(nèi)消化率。結果表明，發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸含量為52.34%;發(fā)酵后體外消化率由67.44%提高至82.20%;在動物體內(nèi)具有良好的消化率，達到85.43%。發(fā)酵角蛋白產(chǎn)品作為飼料蛋白添加劑完全可行，可用于替代或部分替代魚粉、豆粕等一些價格較高的蛋白飼料原料。

參考文獻：

[1]Marshall R C，Orwin D F，Gillespie J M. Structure and biochemistry of mammalian hard keratin[J]. Electron Microscopy Reviews，1991，4（1）：47-83.

[2]Wang X，Parsons C M. Effect of processing systems on protein quality of feather meals and hog hair meals[J]. Poultry Science，1997，76（3）：491-496.

[3]Latshaw J D，Musharaf N，Retrum R. Processing of feather meal to maximize its nutritional value for poultry[J]. Animal Feed Science and Technology，1994，47（3/4）：179-188.

[4]朱曉飛，張 玲，趙平芝，等. 鏈霉菌B221的角蛋白降解機制初探[J]. 中國農(nóng)學通報，2007，23（6）：18-22.

[5]聶慶霽，史玉峰，王 玲，等. 地衣芽孢桿菌nju-1411-1降解羽毛角蛋白過程中含硫化合物的變化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2010，38（4）：258-261.

[6]羅 蕾，史玉峰，崔丹丹，等. 4種含硫化合物對鏈霉菌B221固體發(fā)酵羽毛角蛋白過程的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（2）：310-313.

[7]Boisen S，F(xiàn)ernandez J A. Prediction of the apparent ileal digestibility of protein and amino acids in feedstuffs and feed mixtures for pigs by in vitro analyses[J]. Animal Feed Science and Technology，1995，51（1）：29-43.

[8]譙仕彥，李德發(fā)，楊 勝.不同加工處理的大豆蛋白日糧對仔豬斷奶后腹瀉影響的研究[J]. 動物營養(yǎng)學報，1995，7（4）：1-6.

[9]董榮斌，張 玲，朱曉飛，等. 耐熱鏈霉菌B221降解羽毛角蛋白的固體發(fā)酵條件研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2007（6）：249-251，267.

[10]Pandy A，Socool C R，Mitchell D. New developments in solid state fermentation：Ⅰ. Bioprocesses and products[J]. Process Biochemistry，2000，35（10）：1153-1169.

[11]張 洋. 一種新型角蛋白酶的發(fā)酵、理化性質及應用研究[D]. 福州：福州大學，2005：35-49.

[12]李寶林，張維金，崔德成. 酶解羽毛粉加工方法的研究及在飼料中的使用[C]//中國家禽科學研究進展——第十四屆全國家禽科學學術討論會論文集. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術出版社，2009：790-794.

[13]李曉燕，喻 洋，肖英平，等. 酶解羽毛粉的體外蛋白質消化率及其在生長豬日糧中的應用效果[J]. 中國畜牧雜志，2012，48（15）：33-36.