4種方法檢測(cè)8個(gè)菊花品種花粉活力的比較

涂清芳 賈雪晴 姜自紅

摘要：花粉活力是雜交育種能否成功的決定因素之一。研究4種方法測(cè)定8個(gè)菊花品種的花粉活力。結(jié)果表明，8個(gè)菊花品種中，遲黃花粉活力最高，其次為杭白菊，再次為黃山貢菊和白/黃香梨，然后為滁菊和亳菊;白金菊花粉活力較低，金絲皇菊花粉活力最低，部分品種間花粉活力存在顯著差異（P<0.05）;對(duì)于滁菊和杭白菊，3種快速測(cè)定法中，I2-KI法的測(cè)定值更接近離體萌發(fā)法，而關(guān)于I2-KI法是否為菊花花粉快速測(cè)定的最佳方法，仍需進(jìn)一步試驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：菊花;花粉活力;測(cè)定方法

中圖分類(lèi)號(hào)： S682.1+10.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）02-0109-03

菊花[Dendranthema morifolium （Ramat. ）Tzvel.]是中國(guó)的傳統(tǒng)名花，其觀賞價(jià)值高，歷來(lái)受到中國(guó)文人雅士的推崇和百姓的喜愛(ài)。隨著育種技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在已有數(shù)千個(gè)園藝品種，應(yīng)用方式多種多樣，更是產(chǎn)生了較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益。在菊花的眾多育種方法中，雜交育種是最基本、最常用、最簡(jiǎn)單且最有成效的方法[1-4]。授粉是影響雜交育種結(jié)實(shí)率的重要因素[5]?；ǚ凼潜蛔又参锏男叟渥芋w，在植物的有性繁育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。父本具有良好的花粉活力是菊花成功進(jìn)行雜交育種的重要條件。本試驗(yàn)通過(guò)運(yùn)用多種花粉活力快速測(cè)定法和離體萌發(fā)法測(cè)定8個(gè)菊花品種（或變種）的花粉活力，以初步判斷其花粉細(xì)胞活性，為菊花雜交育種組合方案的制定提供參考依據(jù)，同時(shí)還可比較不同花粉活力測(cè)定方法的優(yōu)劣，為菊花花粉活力測(cè)定方法的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用材料編號(hào)、品種及材料來(lái)源見(jiàn)表1，主要來(lái)自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)的資源圃。2017年11月正值各品種菊花盛花期間，選擇晴天的上午采集各品種盛開(kāi)的花序，帶回實(shí)驗(yàn)室取花粉進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

所有試驗(yàn)選擇在2017年11月15—21日期間，正值菊花的盛花期，在滁州職業(yè)技術(shù)學(xué)院志勤樓2202實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 方法

1.3.1 快速測(cè)定花粉活力

1.3.1.1 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法 稱(chēng)取0.03 g TTC 溶解在10 mL磷酸鹽緩沖溶液中， 置于棕色試劑瓶中待用。將1～2滴TTC溶液滴于凹面載玻片的凹陷處，取新鮮花粉散置其中，蓋上蓋玻片。然后放于35 ℃恒溫箱中，染色20 min左右，進(jìn)行鏡檢，有生活力的花粉粒呈紅色，有微弱活力的花粉粒呈淡紅色，無(wú)活力或不育的花粉無(wú)色[6]。每個(gè)品種做3個(gè)玻片，每個(gè)玻片取5個(gè)固定大小的視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每個(gè)視野中的花粉粒數(shù)不少于50粒?；ǚ刍盍?被染為紅色的花粉數(shù)量/總花粉粒數(shù)量×100%。

1.3.1.2 醋酸洋紅染色法 配制1%醋酸洋紅溶液，置于棕色試劑瓶中待用。取少量新鮮花粉置于凹面載玻片凹陷處，滴1～2滴醋酸洋紅溶液，蓋上蓋玻片，染色5～10 min，鏡檢，呈深紅色的花粉粒有生活力，呈淡紅色的則無(wú)生活力[7]。同樣，每個(gè)品種做3個(gè)玻片，每個(gè)玻片取5個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.1.3 I2-KI染色法 配置2% I2-KI溶液，置于棕色試劑瓶中待用。取少量新鮮花粉置于凹面載玻片凹陷處，滴2滴I2-KI溶液染色，5 min后在顯微鏡下觀察。同樣，每品種做3個(gè)玻片，每個(gè)玻片取5個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。有生活力的花粉呈藍(lán)色，生活力衰弱的花粉或內(nèi)含物少的花粉呈黃褐色?；ǚ刍盍?藍(lán)色花粉數(shù)量/總花粉數(shù)量×100%[8]。

1.3.2 離體萌發(fā)法測(cè)定花粉活力 配制配方為100 g/L蔗糖+50 mg/L 硼酸+30 mg/L CaCl2+7 g/L瓊脂+200 g/L PEG4000的固體培養(yǎng)基，在凝固前用移液槍移取100～150 μL 滴于凹玻片凹陷處，取花粉散置于培養(yǎng)基上，然后放入底部有潮濕濾紙的培養(yǎng)皿中，在20 ℃黑暗條件下培養(yǎng)2 h以上。在顯微鏡下檢測(cè)花粉萌發(fā)情況[9]。花粉管長(zhǎng)度大于花粉直徑視為花粉粒萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，否則視為不萌發(fā)[10]。萌發(fā) 率= 萌發(fā)的花粉數(shù)量/檢測(cè)的花粉粒總數(shù)量×100%。

1.3.3 花粉活力測(cè)定方法比較 相對(duì)于各種花粉活力快速測(cè)定法，花粉離體萌發(fā)法的測(cè)定結(jié)果更接近真實(shí)情況。故以花粉萌發(fā)法為依據(jù)，比較TTC法、醋酸洋紅染色法、I2-KI染色法的測(cè)定值，以確定適于菊花花粉活力的快速測(cè)定方法[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，每次重復(fù)統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野，所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC法測(cè)定8個(gè)菊花品種的花粉活力比較

用TTC法檢測(cè)8個(gè)菊花品種的花粉活力，花粉被染成紅色和淡紅色，仔細(xì)觀察使能區(qū)分是否有活力?；ǚ刍盍ε琶?位的品種分別是遲黃、杭白菊和滁菊，活力排名最后2位的是白金菊和金絲皇菊（表2）。經(jīng)方差分析，其中杭白菊與滁菊差異不大，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;白/黃香梨與滁菊差異不大，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;亳菊與黃山貢菊差異不大，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。除此之外，其他品種的花粉活力兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 醋酸洋紅染色法測(cè)定8個(gè)菊花品種的花粉活力比較

用醋酸洋紅染色法檢測(cè)8個(gè)菊花品種的花粉活力，花粉基本被染成深紅色，極少為淺紅色，花粉活力明顯偏高，其中遲黃、黃山貢菊和滁菊的花粉活力高達(dá)100.0%。而活力排名最后的金絲皇菊，花粉活力也高于90.0%。經(jīng)方差分析，其中白金菊、白/黃香梨、杭白菊、滁菊、黃山貢菊、遲黃6個(gè)品種的花粉活力兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

2.3 I2-KI染色法測(cè)定8個(gè)菊花品種的花粉活力比較

用I2-KI法檢測(cè)8個(gè)菊花品種的花粉活力，染色結(jié)果比較清晰，藍(lán)色和黃褐色的花粉容易區(qū)分?；ǚ刍盍ε琶?位的分別是杭白菊、遲黃和黃山貢菊，活力排名最后2位的是白金菊和金絲皇菊（表4）。經(jīng)方差分析，其中滁菊、白/黃香梨、黃山貢菊3個(gè)品種的花粉活力兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;遲黃和杭白菊比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;除此之外， 其他品種的花粉活力兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 離體萌發(fā)法測(cè)定8個(gè)菊花品種的花粉活力比較

用離體萌發(fā)法檢測(cè)8個(gè)菊花品種的花粉活力，萌發(fā)花粉管的花粉數(shù)量不多，整體花粉活力較快速檢測(cè)法的測(cè)定值低，其中排名前3位的是遲黃、白/黃香梨和杭白菊，排名最后2位的是白金菊和金絲皇菊（表5）。經(jīng)方差分析，其中杭白菊、白/黃香梨、黃山貢菊3個(gè)品種的花粉活力兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;滁菊和黃山貢菊比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;亳菊和白金菊比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;除此之外，其他品種的花粉活力兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

4種方法測(cè)定8個(gè)菊花品種的花粉活力比較結(jié)果見(jiàn)圖1。其中，不同染色方法對(duì)菊花品種花粉活力的測(cè)定效果見(jiàn)圖2。

2.5 3種快速測(cè)定花粉活力方法的比較

3種快速測(cè)定花粉活力的方法簡(jiǎn)便易行，但準(zhǔn)確度不高，而離體萌發(fā)法測(cè)定花粉活力更接近真實(shí)結(jié)果。由于醋酸洋紅法檢測(cè)花粉活力，測(cè)定值普遍很高，明顯失真，首先將其排除。因此，以滁菊、杭白菊、亳菊3個(gè)菊花品種為例，以離體萌發(fā)法的測(cè)定值為參照，將TTC法、I2-KI染色法快速測(cè)定花粉活力的測(cè)定值和其進(jìn)行比較，以選出適宜菊花的花粉活力快速測(cè)定的方法。因數(shù)據(jù)不具有方差齊性，選擇Dunnetts T3進(jìn)行兩兩分析的比較，結(jié)果見(jiàn)表6。

由方差分析可得，F(xiàn)滁菊=344.68，F(xiàn)杭白菊=502.47，F(xiàn)亳菊=323.65，P<0.001。進(jìn)一步進(jìn)行Dunnetts T3檢驗(yàn)，亳菊的TCC法與I2-KI法檢測(cè)所得花粉活力之間無(wú)顯著性差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。滁菊和杭白菊的TCC法與I2-KI法、TCC法與離體萌發(fā)法、I2-KI與離體萌發(fā)法檢測(cè)結(jié)果之間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，存在顯著性差異（P<0.05）。根據(jù)表6的數(shù)據(jù)，可以在一定程度上認(rèn)為，滁菊和杭白菊在花粉活力的快速檢測(cè)方法上，I2-KI法的測(cè)定值更接近離體萌發(fā)法。

3 討論與結(jié)論

3.1 8個(gè)菊花品種的花粉活力比較

4種方法測(cè)定的8個(gè)菊花品種的花粉活力值各不相同，其中遲黃在3種方法中排序第1，在另一種方法中排序第2;杭白菊在4種方法中均排序前4;黃山貢菊和白/黃香梨在3種方法中均排序前4;白金菊在3種方法中均排序第7;金絲皇菊在4種方法中均排序第8。因此，整體比較可認(rèn)為，8個(gè)菊花品種中，遲黃的花粉活力最高，其次為杭白菊，再次為黃山貢菊和白/黃香梨，然后為滁菊和亳菊，金絲皇菊的花粉活力最低，且和其他品種均有顯著性差異，另外，白金菊的花粉活力也較低。從理論上講，花粉活力較低的金絲皇菊和白金菊不適宜選作雜交育種的父本。在本試驗(yàn)中，金絲皇菊和白金菊測(cè)得的花粉活力較低。從形態(tài)上看，金絲皇菊的花粉量少，白金菊的花粉被花被包圍不易取，取花粉時(shí)這2個(gè)品種的花粉更容易受操作及外界影響。這在一定程度上也許會(huì)影響花粉活力，但尚屬推論，需要進(jìn)一步試驗(yàn)。

3.2 花粉活力測(cè)定方法的比較

首先，離體萌發(fā)法測(cè)定菊花花粉活力比快速測(cè)定法的結(jié)果更真實(shí)。而3種快速測(cè)定花粉活力方法的測(cè)定值均偏高，并不能反映花粉本身的可育性和受精力。其中，醋酸洋紅法的測(cè)定值過(guò)高，參考價(jià)值不大。將滁菊、杭白菊、亳菊的TCC法、I2-KI法與離體萌發(fā)法測(cè)定的花粉活力，通過(guò)Dunnetts T3進(jìn)行兩兩比較和檢驗(yàn)，對(duì)于滁菊、杭白菊來(lái)說(shuō)，可以認(rèn)為3種方法中，I2-KI法的測(cè)定值更接近離體萌發(fā)法。而對(duì)于亳菊來(lái)說(shuō)，尚不能得出這個(gè)結(jié)論。

另外，快速測(cè)定花粉活力的方法還有MTT染色法、聯(lián)苯胺染色法等，因此關(guān)于I2-KI是否確實(shí)為菊花快速測(cè)定花粉活力方法中更接近離體萌發(fā)法的方法，仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

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