絮凝菌WSZ03的廉價培養(yǎng)及其處理糖蜜乙醇廢液的研究

李夢茜 曹忠旺 張仁文

摘要：從制糖廠廢液污泥中分離篩選得到具有高絮凝活性的絮凝菌株WSZ03，采用分子生物學(xué)結(jié)合形態(tài)學(xué)特征對WSZ03菌株進(jìn)行鑒定，通過內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，簡稱ITS）序列分析結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察確定WSZ03屬曲霉屬。探討利用糖蜜乙醇廢液對其進(jìn)行廉價培養(yǎng)及同時處理糖蜜乙醇廢液的可行性。結(jié)果表明，該菌株培養(yǎng)48 h的菌液適合作為絮凝菌種;WSZ03絮凝菌對糖蜜乙醇廢水的最佳絮凝條件如下：接種量2%、培養(yǎng)時間36 h、溫度28～34 ℃，pH值6。糖蜜乙醇廢水的化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，簡稱COD）去除率達(dá)到75.00%，色度去除率為62.50%，濁度去除率為88.89%。

關(guān)鍵詞：絮凝菌;糖蜜乙醇廢液;廉價培養(yǎng);絮凝條件

中圖分類號： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0261-03

收稿日期：2017-09-12

基金項目：廣西高校中青年教師基礎(chǔ)能力提升項目（編號：KY2016LX286）;河池學(xué)院校級重點科研課題（編號：XJ2016ZD001）;河池學(xué)院校級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃（編號：SJ2016042）;廣西壯族自治區(qū)級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃（編號：201710605096）。

作者簡介：李夢茜（1986—），女，河南周口人，碩士，講師，主要從事微生物天然產(chǎn)物方向的研究。E-mail：limengxi66@126.com。

通信作者：張振旺，博士研究生，主要從事分子生物學(xué)方向的研究。E-mail：zhenwangzhang@126.com。 糖蜜乙醇廢水是以糖廠制糖副產(chǎn)品糖蜜為原料，在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇過程中產(chǎn)生的高濃度有機廢水，含有大量碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、纖維素等有機物，如果直接排放，會造成水體富營養(yǎng)化，其結(jié)果是水體黑臭，甚至失去功能，從而嚴(yán)重影響環(huán)境[1-2]。目前，該類廢水的常規(guī)處理方法為生化處理法、化學(xué)處理法或多種方法的組合工藝等[3]。微生物絮凝劑（MBF）是利用生物技術(shù)，從微生物體或其分泌物中提取純化而獲得的一種天然高分子絮凝劑，該類絮凝劑可使液體中不易降解的固體懸浮顆粒發(fā)生凝聚沉降，是具有生物分解性和安全性的高效、無毒、無二次污染的綠色水處理劑。近年來，有不少學(xué)者報道了微生物絮凝劑在污水處理中的應(yīng)用[4-10]，但是由于MBF制備成本高，產(chǎn)量低，生產(chǎn)菌種篩選困難，導(dǎo)致目前微生物絮凝劑多處于實驗室研究階段，在工業(yè)上并未得到廣泛推廣。因此，尋找廉價、高效的微生物絮凝劑生產(chǎn)方法，能有效地推動其廣泛應(yīng)用。

針對上述問題，本研究以糖蜜乙醇廢水為培養(yǎng)基主要成分，從糖廠廢液污泥中篩選對糖蜜乙醇廢水具有絮凝活性的絮凝菌，通過比較廢水處理前后的化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，簡稱COD）、濁度、色度的變化，對絮凝菌的最佳絮凝條件進(jìn)行優(yōu)化，以得到對糖蜜乙醇廢水較理想的處理效果。

1 材料與方法

1.1 菌種來源與培養(yǎng)基

菌種：從宜州博慶公司懷遠(yuǎn)糖廠的廢水污泥中篩選得到。固體培養(yǎng)基：10倍液糖蜜乙醇廢液1 000 mL，瓊脂粉20 g，調(diào)節(jié)pH值為7.0。液體培養(yǎng)基：10倍液糖蜜乙醇廢水，調(diào)節(jié)pH值為7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種分離與篩選 采用稀釋涂布法將污泥進(jìn)行梯度稀釋，并涂布在滅菌的平皿培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，用劃線法純化得到單一菌落，將純菌落接種于裝有50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于28 ℃、80 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)48 h得到菌株發(fā)酵液，測定菌株發(fā)酵液和初始液體培養(yǎng)基的吸光度，進(jìn)行絮凝活性的初步分析。

1.2.2 絮凝率的測定 吸取靜置20 min的菌株發(fā)酵上清液，采用二極管陣列分光光度計，在550 nm處測定吸光度（以D550 nm（B）表示），取稀釋10倍的糖蜜乙醇廢液，以550 nm處的吸光度（以D550 nm（A）表示）為對照，計算絮凝菌的絮凝率：

絮凝率=（D550 nm（A）-D550 nm（B））/D550 nm（A）×100%。

1.2.3 菌種鑒定 采用平板劃線法獲得單菌落，觀察菌落生長形態(tài)，并借助顯微鏡觀察菌絲和孢子形態(tài)，以初步鑒定菌屬，同時結(jié)合基因序列的測定確定菌屬，其中基因序列的測定先使用生工生物工程（上海）股份有限公司的DNA提取試劑盒提取目標(biāo)菌株的基因組DNA，以ITS1+ITS4作為擴(kuò)增真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，簡稱ITS）的通用引物，交由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，再將所得測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對分析。

1.2.4 絮凝條件的優(yōu)化

1.2.4.1 單因素試驗 考察接種量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和初始pH值等4個因素對WSZ03絮凝效果的影響。

（1）接種量。將于28 ℃、80 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)48 h得到的菌液作為種子液（菌體濃度104 CFU/mL），接入糖蜜乙醇廢液裝液量為50 mL的250 mL三角瓶中，接種量分別為1%、2%、4%、6%、8%、10%，在搖床中振蕩培養(yǎng)，得到菌株發(fā)酵液，測定菌株發(fā)酵液、發(fā)酵培養(yǎng)基的吸光度，計算絮凝率。

（2）培養(yǎng)時間。在250 mL三角瓶中加入50 mL糖蜜乙醇廢水，再接入種子液，接著于28 ℃、80 r/min搖床中分別培養(yǎng)6、12、18、24、30、36、42、48 h，得到菌株發(fā)酵液，測定菌株發(fā)酵液、發(fā)酵培養(yǎng)基的吸光度，計算絮凝率。

（3）培養(yǎng)溫度：在250 mL三角瓶中加入50 mL糖蜜乙醇廢水，接入種子液，接著分別在22、25、28、31、34、37 ℃下 80 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng)，得到菌株發(fā)酵液，測定菌株發(fā)酵液和發(fā)酵培養(yǎng)基的吸光度，計算絮凝率。

（4）初始pH值：在250 mL三角瓶中加入50 mL糖蜜乙醇廢水，利用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH分別調(diào)節(jié)pH值為3、4、5、6、7、8、9、10后接入種子液，接著在28 ℃、80 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，得到菌株發(fā)酵液，測定菌株發(fā)酵液、發(fā)酵培養(yǎng)基的吸光度，計算絮凝率。

1.2.4.2 正交試驗 設(shè)計接種量、絮凝時間、溫度、初始pH值等4個因素的3個水平，考察影響絮凝率的條件，以得出絮凝菌的最佳絮凝條件，因素水平設(shè)計見表1。

1.2.5 處理糖蜜乙醇廢水 在最佳絮凝條件下，用絮凝菌對糖蜜乙醇廢水進(jìn)行處理，比較處理前后水質(zhì)的參數(shù)變化，衡量水質(zhì)參數(shù)的指標(biāo)為COD、色度和濁度。

采用COD測定計（型號：A-7325）測量COD，采用濁度儀 （型號：BTCJ-TSS）測量濁度，利用色度計（HI93727色度比色計）測定色度。

2 結(jié)果與分析

2.1 絮凝劑產(chǎn)生菌的選擇

從宜州博慶公司懷遠(yuǎn)糖廠的廢水污泥中經(jīng)初篩、復(fù)篩分離純化得到1株具有高絮凝活性的菌株，其絮凝率為92%，因此選擇該菌株用于后續(xù)試驗。

2.2 絮凝劑產(chǎn)生菌的鑒定

菌種形態(tài)學(xué)觀察及ITS序列的測序鑒定：在固體培養(yǎng)基上于28 ℃培養(yǎng)2 d，可見白色菌絲，3 d開始產(chǎn)生孢子，5 d時孢子成熟。菌落直徑約為3 cm，正面干燥蓬松，呈灰棕色（圖1-a）;孢子呈圓形、灰色（圖1-b）。結(jié)合ITS測序結(jié)果（ITS片段長度為760 bp，圖2），初步判斷WSZ03菌株屬于曲霉屬。

2.3 SWZ03的絮凝率曲線

于稀釋10倍的糖蜜乙醇廢液培養(yǎng)基中接入1%絮凝菌孢子懸液，不同培養(yǎng)時間段對糖蜜乙醇廢液的絮凝效果見圖3?？梢缘贸觯摼囵B(yǎng)在48 h時達(dá)到較高的絮凝活性，通過測定菌體濕質(zhì)量可知，此時菌體的生物量也已經(jīng)達(dá)到最高水平。因此，后續(xù)試驗均采用培養(yǎng)48 h的菌液作為菌種。

2.4 接種量對WSZ03絮凝效果的影響

采用“1.2.4.1”節(jié)中的試驗方法，考察接種量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和初始pH值等4個因素對絮凝菌絮凝效果的影響。由圖4至圖7的單因素絮凝試驗結(jié)果表明，接種量對絮凝活性的影響不大，當(dāng)接種量為2%時，絮凝效果明顯;當(dāng)培養(yǎng)時間為36 h時，絮凝率較高;培養(yǎng)溫度對絮凝活性的影響亦不明顯，31 ℃時的絮凝率較高;當(dāng)初始pH值為6時，絮凝率較高。

2.5 絮凝條件的正交試驗

按照“1.2.4.2”節(jié)的試驗方法對以上影響絮凝效果的4個因素做4因素3水平正交試驗。由表2可知，4個因素極差從小到大的順序為時間<溫度<接種量見，4個因素對WSZ03菌株絮凝效果的影響程度排序為pH值>接種量>溫度>時間。結(jié)合單因素試驗結(jié)果，綜合分析得出絮凝菌的最優(yōu)絮凝條件如下：接種量為2%，絮凝時間為36 h，溫度為 28～34 ℃，pH值為6。

2.6 糖蜜乙醇廢水的處理

利用“2.5”節(jié)中確定的最優(yōu)絮凝條件，測定懷遠(yuǎn)糖廠糖蜜乙醇廢水經(jīng)WSZ03絮凝處理后的COD、濁度和色度去除率。由圖8可知，糖蜜乙醇廢水的COD去除率達(dá)到75.00%，色度去除率為62.50%，濁度去除率為88.89%。菌株WSZ03對糖廠糖蜜乙醇廢液有較好的處理效果，尤其對濁度的清除效果比較明顯。

3 結(jié)論與討論

本研究利用糖蜜乙醇廢液對微生物絮凝菌進(jìn)行廉價培養(yǎng)，同時考察處理糖蜜乙醇廢液的可行性。本試驗的優(yōu)勢在于降低了微生物絮凝劑的培養(yǎng)成本。結(jié)果表明，本研究篩選出的WSZ03菌株對糖廠糖蜜乙醇廢水有明顯的絮凝效果。菌株WSZ03對糖蜜乙醇廢水的最佳絮凝條件如下：接種量為2%，時間為36 h，溫度為28～34 ℃。菌株WSZ03所產(chǎn)絮凝活性物質(zhì)對糖蜜乙醇廢水COD的去除率為75.00%，色度去除率為62.50%，濁度去除率為88.89%。筆者所在團(tuán)隊利用WSZ03菌株處理其他種類廢水，如重金屬廢水、煤泥廢水等發(fā)現(xiàn)，WSZ03菌株絮凝劑有寬泛的適用范圍，具有一定的實際應(yīng)用前景。糖蜜乙醇廢液含有大量難降解的有機物，并且色度高，通過單一絮凝菌株處理很難實現(xiàn)達(dá)標(biāo)排放，因此在實際應(yīng)用中，需要考慮采用混合菌種產(chǎn)生的復(fù)合絮凝劑以增強糖蜜乙醇污水的處理效果，或者與其他處理技術(shù)聯(lián)合使用，進(jìn)行污水處理研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Mudoga H L，Yucel H，Kincal N S. Decolorization of sugar syrups using commercial and sugar beet pulp based activated carbons[J]. Bioresource Technology，2008，99（9）：3528-3533.

[2]廖 雷，師杰峰，彭 娟，等. 固定化生物活性炭處理糖蜜酒精廢水[J]. 環(huán)境工程學(xué)報，2017，11（2）：727-732.

[3]銀星宇. 甘蔗糖蜜酒精廢液治理工藝研究[D]. 長沙：中南大學(xué)，2005.

[4]王 偉，楊志超，劉生玉. 微生物絮凝劑GSY-9對煙煤煤泥水的絮凝機理研究[J]. 煤炭工程，2017，49（1）：123-126.

[5]羅 平，楊林玉，衛(wèi)宏毅. 微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 工業(yè)用水與廢水，2017，48（1）：50-55.

[6]馬 放，段姝悅，孔祥震，等. 微生物絮凝劑的研究現(xiàn)狀及其發(fā)展趨勢[J]. 中國給水排水，2012，28（2）：14-17.

[7]石春芳，冷小云. 微生物絮凝劑在制藥廢水處理中的應(yīng)用研究[J]. 現(xiàn)代化工，2015，35（9）：85-89.

[8]Zhang X H，Shuang-Shi L I，Yang G W，et al. Preparation of flocculant-producing microorganism and property analysis of microbial flocculant[J]. Safty and Environmental Engineering，2008（4）：39-42.

[9]毛艷麗，閆永勝，劉瑞群，等. 微生物絮凝劑及其產(chǎn)生菌的研究新進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報，2008，35（10）：1616-1620.

[10]毛艷麗，朱 濤，裴中芳，等. 利用糖蜜廢水生產(chǎn)微生物絮凝劑及條件優(yōu)化和效果實驗研究[J]. 環(huán)境工程學(xué)報，2010，4（1）：86-90. 張玉千，周 學(xué)，鄭 丹，等. 虎杖苷轉(zhuǎn)化菌的篩選及所產(chǎn)酶的性質(zhì)研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（1）：264-267.