薏苡種質(zhì)資源中甘油三油酸酯和薏苡素的測定

蒙秋伊 付瑜華 申剛

摘要：采用高效液相色譜法（HPLC）分析比較24份薏苡仁中甘油三油酸酯、薏苡根中薏苡素含量的差異，結(jié)果表明，24份薏苡種質(zhì)的薏苡仁中甘油三油酸酯含量存在較大差異，Y78、Y28、Y83、Y24、Y8、Y216、Y14這7份種質(zhì)的薏苡仁中甘油三油酸酯含量低于0.5%，其他均高于0.5%;甘油三油酸酯含量最高的種質(zhì)Y166比最低的種質(zhì)Y78高 3.82倍，薏苡根中薏苡素含量最高的種質(zhì)Y229比最低的種質(zhì)Y211高1.22倍;種質(zhì)Y166、Y164的甘油三油酸酯、薏苡素含量均較高，可作為薏苡品種選育的親本材料。

關(guān)鍵詞：薏苡;甘油三油酸酯;薏苡素;高效液相色譜法

中圖分類號： S519.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0186-03

薏苡（Coix lacryma-jobi L.）為禾本科薏苡屬1年生或多年生草本植物，別稱薏仁米、六谷子、藥玉米等，是傳統(tǒng)藥食兼用經(jīng)濟(jì)作物，具有極高的營養(yǎng)價值和重要的藥用價值[1-2]。薏苡干燥成熟種仁具有利水滲濕、健脾止瀉、除痹、排膿、解毒散結(jié)等功效[3]。有研究表明，薏苡對肉瘤、肝癌、胃癌、肺癌等具有較好療效[4-6]，其抗腫瘤主要活性成分為薏苡仁油中的甘油三酯類成分（TAGs），其中包括甘油三油酸酯、甘油三亞油酸酯、1，2-油酸-3-亞油酸-甘油三酯、1，2-亞油 酸-3-油酸-甘油三酯等，《中國藥典》2015年版以甘油三油酸酯作為評價薏苡仁藥材質(zhì)量指標(biāo)成分[3]。目前，抗腫瘤藥康萊特注射液的主要成分就是薏苡仁油，并作為一種較為理想的抗腫瘤藥物廣泛應(yīng)用于肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、鼻咽癌、腎癌等的治療或輔助治療[7-9]。薏苡根收載于貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（2003年版），為貴州少數(shù)民族用藥，其作用成分為薏苡素，具有清熱利濕、健脾和殺蟲等功效，用于治療熱淋、血淋、石淋、黃疸、水腫、白帶過多、腳氣、風(fēng)濕痹痛和蛔蟲病等癥[10]。

薏苡種質(zhì)資源中甘油三油酸酯和薏苡素的含量差異較大，導(dǎo)致薏苡品質(zhì)良莠不齊。甘油三油酸酯一般在薏苡種仁中提取[11-14]，而薏苡素則以薏苡根部含量相對最高[15-16]，2種藥用成分主要提取部位不同。為達(dá)到有效利用，須同時采收薏苡仁、薏苡根分別提取薏苡甘油三油酸酯、薏苡素，而培育一個甘油三油酸酯、薏苡素含量高的“雙高”薏苡品種十分有價值。本試驗以藥典指標(biāo)成分甘油三油酸酯、薏苡素為研究指標(biāo)，考察貴州省亞熱帶作物研究所24份薏苡種質(zhì)資源其成分含量差異，初步評價其藥材品質(zhì)，為優(yōu)質(zhì)“雙高”薏苡的選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Prominence LC-20A型液相色譜儀，由日本島津公司生產(chǎn);Alltech ELSD 3300型蒸發(fā)光散射器，北京奧泰科技有限公司提供;KQ5200E型超聲波清洗器，由昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn);RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，由上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn);FS-Ⅱ型藥材粉碎機(jī)，由廣州航信科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);BSA224S型電子天平，由賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司生產(chǎn)。使用化學(xué)試劑有乙腈、二氯甲烷、甲醇（Merck公司生產(chǎn)，色譜純）;試驗用水為娃哈哈純凈水;對照品甘油三油酸酯、薏苡素，分別購于Sigma公司、卡邁舒（上海）生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98.0%。

1.2 試驗前期處理

試驗于2016年11月在貴州師范大學(xué)分析測試中心進(jìn)行，分別采集24份來源不同的薏苡種質(zhì)資源（表1）成熟種子及成熟期根;種子脫殼得薏苡仁，烘箱中40 ℃烘24 h，粉碎，過100目篩，備用;成熟期根用烘箱中40 ℃烘干，粉碎，過40目篩，備用。

1.3 對照品和供試品溶液的制備

精確稱取甘油三油酸酯對照品適量，加流動相制成 0.14 mg/mL 的溶液;精確稱取薏苡素對照品適量，加甲醇配制成0.096 mg/mL的溶液。稱量薏苡仁粉末0.1 g于20 mL瓶中，加入乙腈、二氯甲烷質(zhì)量比為59 ∶ 41的流動相5 mL;浸泡過夜，超聲30 min;取出，冷卻，稱質(zhì)量，加同樣的流動相補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻;濾紙過濾，濾液用有機(jī)膜過濾;采用高效液相色譜法（HPLC）分析濾液的甘油三油酸酯含量。稱量薏苡根粉末大約1 g于索氏提取器，加丙酮提取至無色;待提取液揮發(fā)干，25 mL容量瓶中加甲醇溶解定容;有機(jī)膜過濾，采用高效液相色譜法（HPLC）分析濾液的薏苡素含量。

1.4 液相色譜條件

測量甘油三油酸酯的色譜條件：色譜柱為250 mm×4.60 mm、5 μm phenomenex C18柱，流動相為乙腈、二氯甲烷質(zhì)量比為59 ∶ 41，流量為0.7 mL/min，色譜柱溫度為30 ℃;蒸發(fā)光散射檢測器檢測。測量薏苡素的色譜條件：色譜柱為250 mm×4.60 mm、5 μm wondasil C18柱;流動相為乙腈、水、磷酸質(zhì)量比為25 ∶ 75 ∶ 0.1，流速為0.7 mL/min，色譜柱溫度為25 ℃，紫外檢測器波長為232 nm。對照品和供試品溶液的高效液相色譜見圖1。

1.5 高效液相色譜法測試效果檢驗

1.5.1 線性關(guān)系檢驗 分別精確吸取甘油三油酸酯對照品溶液2、5、10、15、20 μL及薏苡素對照品溶液2、4、6、8、10 μL，采用HPLC法分別測定峰面積;以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），分別繪制甘油三油酸酯、薏苡素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢驗線性情況。

1.5.2 精密度檢驗 分別精確吸取甘油三油酸酯、薏苡素對照品溶液10 μL，HPLC法連續(xù)測定6次甘油三油酸酯、薏苡素的峰面積，計算峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.5.3 穩(wěn)定性檢驗 分別精確吸取同一薏苡仁、薏苡根供試品溶液，HPLC法分別測定薏苡仁甘油三油酸酯、薏苡根薏苡素的峰面積，進(jìn)樣時間分別為0、4、8、12、24 h，每次進(jìn)樣量為10 μL，計算峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.5.4 重復(fù)性檢驗 分別稱取已測的同一薏苡仁、薏苡根樣品各6份，薏苡仁0.6 g、薏苡根0.2 g，分別制備成供試品溶液;HPLC法分別測定薏苡仁甘油三油酸酯、薏苡根薏苡素的峰面積，每次進(jìn)樣量為10 μL，計算峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.5.5 加樣回收率檢驗 分別稱取同一薏苡仁、薏苡根樣品各6份，薏苡仁0.5 g、薏苡根1.0 g，分別加入等量的甘油三油酸酯、薏苡素對照品溶液，甘油三油酸酯、薏苡素添加量分別為0.386、0.296 mg，分別制備成供試品溶液，HPLC法測定薏苡仁、薏苡根分別添加甘油三油酸酯、薏苡素的峰面積，計算甘油三油酸酯、薏苡素平均回收率和RSD值。

1.6 供試樣品的測定

分別精確吸取24份薏苡種質(zhì)薏苡仁、薏苡根供試品溶液各10 μL作為進(jìn)樣，HPLC法分別測定薏苡仁、薏苡根峰面積，按外標(biāo)法計算甘油三油酸酯、薏苡素含量。每個樣品重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法測試效果檢驗

2.1.1 線性關(guān)系檢驗 試驗結(jié)果表明，甘油三油酸酯、薏苡素的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=1.292x+17.310（r2=0.983 0）、y=1 997.308x+10.692（r2=0.999 9），線性范圍分別為 0.335～3.1230、0.280～1.310 μg，線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度檢驗 試驗結(jié)果表明，甘油三油酸酯、薏苡素峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.25%、0.96%，說明試驗精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性檢驗 試驗結(jié)果表明，甘油三油酸酯、薏苡素峰面積RSD值分別為0.44%、0.28%，說明試驗穩(wěn)定性良好。

2.1.4 重復(fù)性檢驗 試驗結(jié)果表明，甘油三油酸酯、薏苡素峰面積RSD值分別為1.05%、1.10%，說明試驗重復(fù)性較好。

2.1.5 加樣回收率檢驗 試驗結(jié)果表明，甘油三油酸酯、薏苡素的平均回收率分別為100.5%、98.80%，RSD值分別為1.02%、1.23%，說明試驗方法準(zhǔn)確、可靠。

2.2 供試樣品的測定結(jié)果

由表2可見，24份薏苡種質(zhì)中，薏苡仁中甘油三油酸酯含量達(dá)到0.8%以上的有6份種質(zhì)，分別為Y107、Y164、Y44、Y184、Y84、Y166，其中含量最高的為Y166，達(dá)到0.945%;甘油三油酸酯含量低于0.5%的有7份種質(zhì)，分別為Y78、Y28、Y83、Y24、Y8、Y216、Y14;根中薏苡素含量達(dá)到560 mg/kg以上的有6份種質(zhì)，分別為Y78、Y14、Y24、Y164、Y166、Y229，其中薏苡素含量最高的為Y229，達(dá)到666.7 mg/kg，最低的為Y211，薏苡素含量為300.0 mg/kg。由圖2可知，薏苡仁中甘油三油酸酯含量與薏苡根中薏苡素含量無相關(guān)性。

3 結(jié)論

《中國藥典》2015年版中規(guī)定，薏苡仁中甘油三油酸酯（C57H104O6）含量不得少于0.50%[3]。本試驗測定24份薏苡種質(zhì)的薏苡仁甘油三油酸酯含量發(fā)現(xiàn)，不同種質(zhì)的薏苡仁中甘油三油酸酯含量存在較大差異，Y78、Y28、Y83、Y24、Y8、Y216、Y14這7份種質(zhì)的薏苡仁中甘油三油酸酯含量低于 0.5%，其他均高于0.50%，符合藥典標(biāo)準(zhǔn);甘油三油酸酯含量最高的Y166比最低的Y78高3.82倍;薏苡根中薏苡素量含量相對最高的Y229比最低的Y211高1.22倍;24薏苡種質(zhì)的薏苡根中薏苡素含量與薏苡仁中甘油三油酸酯含量無相關(guān)性。綜合各種質(zhì)中甘油三油酸酯、薏苡素含量看，種質(zhì)Y166、Y164二者相對較高，可作為“雙高”藥用薏苡品種的親本材料。

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