平邑甜茶根尖染色體制片技術(shù)優(yōu)化及核型分析

王彥 華麗源 錢(qián)關(guān)澤

摘要：為探討制備平邑甜茶染色體制片的最佳技術(shù)參數(shù)，以平邑甜茶根尖為試驗(yàn)材料，比較材料的不同采集時(shí)間、預(yù)處理方法、酶解時(shí)間和后低滲時(shí)間對(duì)平邑甜茶根尖染色體制片的影響。結(jié)果表明：在26 ℃培養(yǎng)條件下，平邑甜茶最佳取材時(shí)間為11：00—11：30;4 ℃低溫冰水混合物進(jìn)行預(yù)處理能夠獲得較為分散的染色體標(biāo)本;酶解采用2.5%果膠纖維素混合酶在37 ℃下處理最佳時(shí)間為2 h，后低滲最佳時(shí)間為20 min。核型分析發(fā)現(xiàn)平邑甜茶染色體屬于小型染色體，染色體臂比變化在1.01～2.46之間，差異不大，核型組成成分為中部著絲點(diǎn)染色體（m）、亞中部著絲點(diǎn)染色體（sm），核型屬于2B型。

關(guān)鍵詞：平邑甜茶;根尖;染色體制片;核型分析;去壁低滲法

中圖分類(lèi)號(hào)： Q949.751.8;S685.120.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）01-0091-06

平邑甜茶[Malus hupehensis （Pamp.） Rehd. var. mengshanensis G. Z.Qian]是薔薇科蘋(píng)果屬植物，屬于湖北海棠的一個(gè)變種，典型的無(wú)融合生殖型三倍體植物。20世紀(jì)70年代開(kāi)始，就有人試圖將人類(lèi)染色體標(biāo)本制備方法引用到植物材料上來(lái)[1-3]，如今植物方面的染色體制片已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但是目前在平邑甜茶植物染色體制片方面的報(bào)道很少，林盛華等報(bào)道平邑甜茶為三倍體植物，染色體數(shù)為 2n=3X=51[4]，梁國(guó)魯報(bào)道了用胰酶法誘導(dǎo)山荊子染色體中期G帶的研究[5]，周攀等報(bào)道了利用風(fēng)油精制備平邑甜茶染色體制片技術(shù)的研究[6]。平邑甜茶在細(xì)胞學(xué)方面的研究很少，主要原因在于染色體小，數(shù)量較多，制片時(shí)染色體難分散，制片難度大。染色體制片一般分為壓片法和去壁低滲法。壓片技術(shù)能快速制備染色體臨時(shí)片[7-8]，但壓片法容易殘留過(guò)多的細(xì)胞質(zhì)，且染色后著色程度受染色劑影響很大，染色體和細(xì)胞質(zhì)不易區(qū)分，很難獲得效果好的壓片[9-10]。去壁低滲法可以很好地使染色體分散開(kāi)，但操作中會(huì)受到諸多因素影響，技術(shù)不熟練的情況會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。本試驗(yàn)取平邑甜茶種子根尖運(yùn)用去壁低滲法進(jìn)行染色體制片，從不同取材時(shí)間、預(yù)處理劑、酶解濃度、酶解時(shí)間、后低滲時(shí)間等方面進(jìn)行對(duì)比，對(duì)制片技術(shù)進(jìn)行討論，為平邑甜茶細(xì)胞學(xué)研究提供清晰度高的染色體制片，并且對(duì)其進(jìn)行核型分析，旨在為平邑甜茶基因組原位雜交提供細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)及技術(shù)支撐，奠定山荊子組植物細(xì)胞分子遺傳圖譜的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為平邑甜茶種子根尖，于2016年9月在山東省臨沂市平邑縣采集平邑甜茶果實(shí)，收集種子，晾干后用水浸泡24 h，鋪在有1層濾紙2層紗布的培養(yǎng)皿中，在5 ℃下培養(yǎng) 15 d 打破休眠，放于26 ℃培養(yǎng)箱中，待根尖長(zhǎng)至0.5 cm時(shí)截取并進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 取材時(shí)間 于24 h內(nèi)取平邑甜茶根尖，每隔30 min取材1次，進(jìn)行預(yù)處理制片。

1.2.2 預(yù)處理 分別將所取的根尖材料用0.2%秋水仙素、2 mmol/L 8-羥基喹啉、飽和α溴萘預(yù)處理液處理2～4 h，然后在4 ℃冰水混合物低溫冰浴分別處理21、22、23、24 h。

1.2.3 固定 預(yù)處理后的材料置于-20 ℃的卡諾式固定液[乙醇 ∶ 冰醋酸=3 ∶ 1（V/V）]中固定2～24 h。

1.2.4 前低滲 將平邑甜茶根尖從固定液里取出，用蒸餾水沖洗3次，浸泡10 min后加入到0.075 mol/L KCl溶液中處理30 min進(jìn)行前低滲，使根尖細(xì)胞充分吸水，細(xì)胞器細(xì)胞質(zhì)破散，細(xì)胞壁易于酶解，染色體分散。

1.2.5 酶解 固定24 h以上之后用水沖洗3次，再用濃度為2.5%的果膠酶纖維素酶混合液在37 ℃下分別處理1、2、3 h。

1.2.6 后低滲 將酶解后的根尖細(xì)胞在常溫下蒸餾水浸泡，讓平邑甜茶根尖細(xì)胞吸水更加膨脹，使細(xì)胞壁破裂，細(xì)胞質(zhì)破散，染色體更容易分散，細(xì)胞膜失去約束容易破裂，所以低滲時(shí)間應(yīng)控制在一定范圍，本試驗(yàn)后低滲進(jìn)行3個(gè)時(shí)間處理——10、20、30 min。

1.2.7 鏡檢 之后在NIKON ECLIPSE 80i共聚焦熒光顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)下鏡檢并拍照。

1.2.8 染色體核型分析 選出染色體分散良好的5個(gè)中期細(xì)胞測(cè)量每條染色體長(zhǎng)度（長(zhǎng)、短臂長(zhǎng)度，隨體不計(jì)算在內(nèi)），計(jì)算公式如下：

染色體相對(duì)長(zhǎng)度=（單一染色體總長(zhǎng)度/全組染色體總長(zhǎng)度）×100%;

染色體相對(duì)長(zhǎng)度指數(shù)=單一染色體長(zhǎng)度/全組染色體平均長(zhǎng)度;

臂比值=長(zhǎng)臂長(zhǎng)度（L）/短臂長(zhǎng)度（S）;

核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)=全組染色體長(zhǎng)臂總長(zhǎng)度/全組染色體總長(zhǎng)度×100%;

著絲點(diǎn)指數(shù)=短臂長(zhǎng)度/單一染色體總長(zhǎng)度×100%;

核型分析采用李懋學(xué)與陳瑞陽(yáng)標(biāo)準(zhǔn)[11]，依據(jù)Lever等兩點(diǎn)四區(qū)命名系統(tǒng)[12]，核型分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)參照Stebbins的標(biāo)準(zhǔn)[13]，參照Arano公式[14]計(jì)算核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 取材時(shí)間

不同時(shí)間取材制作的染色體制片觀察結(jié)果見(jiàn)表1，可知平邑甜茶種子根尖最佳取材時(shí)間是一天之中的11：00—11：30，此時(shí)間段的平邑甜茶種子根尖生長(zhǎng)旺盛，中期分裂相對(duì)較多，形態(tài)清晰，便于取材制片。

2.2 預(yù)處理劑與預(yù)處理時(shí)間的選擇

對(duì)不同預(yù)處理劑及處理時(shí)間進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表2和圖1。其中使用0.2%秋水仙素和飽和α溴萘溶液處理2 h時(shí)根尖染色體都是凝縮程度不足，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重（圖1-A、圖1-G）;用0.2%秋水仙素處理3 h和4 h粘連聚集現(xiàn)象又很?chē)?yán)重（圖1-B、圖1-C）;飽和α溴萘溶液處理3 h的染色體分散一般，但凝縮過(guò)度（圖1-H），而處理4 h又出現(xiàn)了粘連，染色體依然凝縮過(guò)度（圖1-I）。2 mmol/L 8-羥基喹啉溶液處理一直有粘連現(xiàn)象（圖1-D、圖1-E、圖1-F），也就是說(shuō)用預(yù)處理劑處理平邑甜茶根尖染色體都會(huì)出現(xiàn)粘連和聚集的現(xiàn)象。用4 ℃冰水混合物處理22 h以內(nèi)染色體比較分散，沒(méi)有粘連現(xiàn)象（圖1-J、圖1-K），而4 ℃冰水混合物處理23 h和24 h，染色體就凝縮過(guò)度，并有聚集現(xiàn)象（圖1-L、圖1-M），處理22 h染色體長(zhǎng)度適宜，分散良好，清晰度好，是最佳的預(yù)處理方法（圖1-K），因此本試驗(yàn)以4 ℃低溫處理22 h的方式進(jìn)行預(yù)處理制片。

2.3 解離時(shí)間的選擇

利用2.5%果膠酶纖維素酶混合酶液在37 ℃下進(jìn)行不同時(shí)間的酶解處理比較，結(jié)果見(jiàn)圖1。其中酶解處理0.5 h時(shí)有大量細(xì)胞壁存在，大量的細(xì)胞堆積，不分散（圖1-N）;酶解處理1 h時(shí)細(xì)胞壁酶解效果一般，大量細(xì)胞質(zhì)殘存，染色體稍微粘連，不夠分散（圖1-O）;酶解處理2 h時(shí)，酶解程度適宜，細(xì)胞壁被酶解掉，細(xì)胞質(zhì)分散了，染色體分散良好，計(jì)數(shù)方便（圖1-P）;酶解3 h時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)破裂，染色體發(fā)生了缺失，酶解過(guò)度（圖1-Q）。因此平邑甜茶根尖最佳酶解時(shí)間為2 h，酶解溫度為37 ℃。

2.4 后低滲時(shí)間的選擇

不同后低滲時(shí)間處理比較結(jié)果見(jiàn)圖1，其中后低滲 10 min 時(shí)，平邑甜茶染色體并沒(méi)有分散開(kāi)，有粘連現(xiàn)象，計(jì)數(shù)困難（圖1-R）;后低滲20 min時(shí)染色體分散良好，計(jì)數(shù)方便，背景干凈（圖1-S）;后低滲30 min時(shí)染色體過(guò)于分散，有丟失現(xiàn)象，后低滲過(guò)度（圖1-T）。因此平邑甜茶根尖最佳后低滲時(shí)間為20 min。

2.5 平邑甜茶根尖細(xì)胞染色體核型分析

選擇50個(gè)染色體分散良好的細(xì)胞觀察計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)47個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為51條，3個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為63條，分別占總計(jì)數(shù)的94%和6%，因此確定平邑甜茶體細(xì)胞染色體數(shù)目為2n=51。根據(jù)平邑甜茶中期染色體對(duì)平邑甜茶進(jìn)行核型分析，詳見(jiàn)圖2、圖3和表3。

按Kuo的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[15]，可將平邑甜茶體細(xì)胞劃分為4個(gè)組：L組（第1、第2、第3、第4對(duì)）、M2組（第5、第6、第7、第8、第9對(duì)）、M1組（第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16對(duì)）、S組（第17對(duì)），染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為2n=51=L+5M2+7M1+1S。

按照Levan等的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[12]，平邑甜茶核型公式為2n=3x=39m+12sm（SAT）。13對(duì)中部著絲粒染色體，4對(duì)近中部著絲粒染色體，在第3對(duì)染色體短臂上帶有隨體，染色體相對(duì)長(zhǎng)度變化是1.3%～2.8%，著絲點(diǎn)指數(shù)變化是28.86%～49.76%，平均臂比值1.50。

根據(jù)Arano的分類(lèi)方法[14]，核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)是64.03%。

根據(jù)Stebbins的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[13]，染色體最長(zhǎng)與最短染色體比值是2.13，臂比值大于2的染色體占全部染色體比例為0.12，屬于2B型。

3 討論

植物染色體制片技術(shù)是植物遺傳學(xué)、染色體工程、植物細(xì)胞生物學(xué)、植物細(xì)胞分類(lèi)學(xué)和物種生物學(xué)等眾多學(xué)科的基本試驗(yàn)技術(shù)[16-18]。植物細(xì)胞染色體的觀察和分析，對(duì)于染色體核型分析以及培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞變異等遺傳學(xué)現(xiàn)象的研究具有重要意義[19]。杜培等對(duì)花生根尖染色體制片，認(rèn)為45%醋酸處理根尖效果比酶解去壁HCl解離經(jīng)濟(jì)實(shí)用，效果相差微小，該方法適用于花生、芝麻、水稻、玉米等植物[20];顧蔚等對(duì)華中五味子染色體制片，發(fā)現(xiàn)用0.1%秋水仙素處理1 h，1 mol/L 鹽酸解離12 min制片分散效果最佳[21];虢國(guó)成等認(rèn)為去壁低滲法制備大麥和玉米染色體制片比壓片效果好[19];李曉玲等用對(duì)二氯苯處理3～4 h，1 mol/L HCl 60 ℃解離 13 min， 改良石碳酸品紅染色10 min制作樹(shù)型金銀花染色體制片最佳[22];洪培培等用0.002 mol/L 8-羥基喹啉處理一串紅根尖并用壓片法制片效果最好[23];王超等用α-溴萘與對(duì)二氯苯混合液，0.002 mol/L 8-羥基喹啉和0.1%秋水仙素，對(duì)木薯根尖預(yù)處理2 h、酶解時(shí)間4 h，染色體制片效果最好[24]。這些研究表明不同物種制作染色體制片最佳處理?xiàng)l件不同，而對(duì)于平邑甜茶染色體制片報(bào)道很少，良好的染色體制片會(huì)受到很多因素的影響，取材就是個(gè)重要因素[21]。通過(guò)對(duì)平邑甜茶的根尖進(jìn)行不同時(shí)間的取材，發(fā)現(xiàn)一天之中 09：00 前，其根尖細(xì)胞基本不分裂，從09：30開(kāi)始平邑甜茶根尖細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入分裂期，但至11：00時(shí)處于分裂中期的細(xì)胞所占比例開(kāi)始增加，持續(xù)到11：30后大部分細(xì)胞進(jìn)入分裂后期直到12：00分裂基本結(jié)束。

染色體制片過(guò)程中預(yù)處理很重要，不少研究表明，預(yù)處理是染色體制備的關(guān)鍵步驟之一[16]。預(yù)處理持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短取決于染色體大小、材料大小、溫度和植物的耐藥性等諸多因素[25]。通過(guò)對(duì)平邑甜茶根尖進(jìn)行4種不同預(yù)處理劑的不同時(shí)間處理，發(fā)現(xiàn)藥物性預(yù)處理都會(huì)普遍導(dǎo)致染色體出現(xiàn)聚集和粘連的現(xiàn)象，處理時(shí)間不夠，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)染色體凝縮過(guò)度，這也印證了前人所述，預(yù)處理過(guò)度，染色體縮得很短，縊痕不清晰，壓片時(shí)部分甚至全部染色體粘連或者聚縮成團(tuán)，尤其是長(zhǎng)時(shí)間處理易引起上述現(xiàn)象的發(fā)生[26]。而4 ℃低溫處理能使染色體凝縮程度適宜，分散良好，冰水混合物處理是比較合適的預(yù)處理方式。

酶解的作用是軟化細(xì)胞壁，并且將細(xì)胞間的果膠層除掉，方便制片。根據(jù)不同酶解時(shí)間的比較試驗(yàn)，確定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)染色體容易缺失，過(guò)短則酶解不徹底，細(xì)胞粘連，染色體不能得到釋放，果膠纖維素混合酶液酶解2 h染色體分散良好，細(xì)胞質(zhì)殘留少。

后低滲是否適宜，常常是試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之一，材料在蒸餾水中停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)引起原生質(zhì)體解體[27]。通過(guò)對(duì)平邑甜茶根尖后低滲時(shí)間的不同處理，發(fā)現(xiàn)后低滲短于10 min原生質(zhì)并未破裂，染色體聚集現(xiàn)象嚴(yán)重，不分散;后低滲長(zhǎng)于 30 min 原生質(zhì)解體，染色體分散過(guò)度，容易丟失，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。通過(guò)比較，后低滲20 min原生質(zhì)剛剛解體，染色體分散良好，易于觀察。

核型分析是探討植物親緣關(guān)系和進(jìn)化趨勢(shì)的一個(gè)重要途徑，核型的類(lèi)型是衡量物種進(jìn)化程度的重要依據(jù)，在長(zhǎng)期進(jìn)化中，染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)都在改變，核型也隨之改變，早在20世紀(jì)80年代，在蘋(píng)果屬核型研究方面就有很多研究報(bào)道，蒲富慎對(duì)蘋(píng)果屬11個(gè)種進(jìn)行染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)山荊子、毛山荊子、新疆野蘋(píng)果較為原始[28]。有研究表明我國(guó)蘋(píng)果屬中22個(gè)不同類(lèi)型染色體數(shù)目和核型進(jìn)而研究進(jìn)化趨勢(shì)[29-30]，林盛華對(duì)蘋(píng)果中3個(gè)雜交種染色體數(shù)目研究發(fā)現(xiàn)了10個(gè)單株是四倍體[4];肖艷等通過(guò)對(duì)蘋(píng)果屬植物6個(gè)類(lèi)型核型分析，證明了蘋(píng)果屬植物多倍體和染色體倍性變異[31];本研究中，觀察到平邑甜茶染色體屬于小型染色體，染色體臂比變化為 1.01～2.46，差異不大，核型組成成分為中部著絲點(diǎn)染色體（m）、亞中部著絲點(diǎn)染色體（sm）核型屬于2B型，這與梁國(guó)魯?shù)葓?bào)道[30]一致。在染色體相對(duì)長(zhǎng)度比，平均臂比、著絲點(diǎn)指數(shù)、相對(duì)長(zhǎng)度、不對(duì)稱(chēng)系數(shù)方面有所差異，導(dǎo)致這種核型差異可能原因是無(wú)融合生殖中染色體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了變化，但核型變化是否影響到繁殖能力，需要進(jìn)一步研究。

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