轉(zhuǎn)基因高通量檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

李夏瑩 陳銳 劉鵬程

摘要：轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用與發(fā)展日新月異，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的需求日趨多樣化、復(fù)雜化，現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)體系已經(jīng)很難滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的需要。近年來，以PCR陣列技術(shù)、芯片技術(shù)、DNA測(cè)序技術(shù)為代表的轉(zhuǎn)基因高通量檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅猛。本文就這一領(lǐng)域的研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要概述。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因;高通量;芯片;DNA測(cè)序

中圖分類號(hào)： S188 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）01-0027-04

以基因工程為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)不僅在資源、環(huán)境和醫(yī)藥等方面日益發(fā)揮著重要作用，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用與發(fā)展也十分迅猛。2016年是轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的第21年，轉(zhuǎn)基因作物的種植面積從1996年的170萬hm2迅速上升到至2016年的1.851億hm2，實(shí)現(xiàn)了近110倍的增長(zhǎng)。2016年也是轉(zhuǎn)基因水果和蔬菜的商業(yè)化快速發(fā)展元年，美國(guó)與加拿大先后批準(zhǔn)了改善營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和耐儲(chǔ)存的轉(zhuǎn)基因蘋果的市場(chǎng)銷售。2016年，全球26個(gè)國(guó)家種植了轉(zhuǎn)基因作物，其中包括19個(gè)發(fā)展中國(guó)家和7個(gè)發(fā)達(dá)國(guó)家。發(fā)展中國(guó)家種植的轉(zhuǎn)基因作物占總面積的54%，而發(fā)達(dá)國(guó)家占46%。包括中國(guó)和印度在內(nèi)的8個(gè)亞太地區(qū)國(guó)家，在2016年種植了 1 860萬hm2 轉(zhuǎn)基因作物。2016年轉(zhuǎn)基因作物的最大種植國(guó)仍然是美國(guó)、巴西、阿根廷、加拿大和印度。這5個(gè)國(guó)家加起來的種植面積達(dá)到了全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的91%[1]。截至目前，我國(guó)共批準(zhǔn)發(fā)放7種轉(zhuǎn)基因作物安全證書，分別是耐儲(chǔ)存番茄、抗蟲棉花、改變花色矮牽牛、抗病辣椒、抗病番木瓜、轉(zhuǎn)植酸酶玉米和抗蟲水稻，但只有抗蟲棉和抗病毒木瓜實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。二十多年來轉(zhuǎn)基因商業(yè)化進(jìn)程帶來的巨大經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益和顯著的生態(tài)效益已充分顯現(xiàn)，它的推廣應(yīng)用速度之快創(chuàng)造了近代農(nóng)業(yè)科技發(fā)展的奇跡。

伴隨轉(zhuǎn)基因作物種植面積的激增以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)研發(fā)的日益加速，以及轉(zhuǎn)基因標(biāo)志制度與監(jiān)管需求，現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)體系已經(jīng)很難滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的需要，影響到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全評(píng)價(jià)、身份驗(yàn)證、國(guó)內(nèi)監(jiān)管、進(jìn)出口檢驗(yàn)、企業(yè)自控和國(guó)際貿(mào)易互認(rèn)，進(jìn)而影響到國(guó)際貿(mào)易和國(guó)家利益。因此，開發(fā)快速、精準(zhǔn)、高通量的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法，建立相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)體系是當(dāng)務(wù)之急。現(xiàn)有的高通量轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)主要包括PCR陣列技術(shù)、芯片技術(shù)、DNA測(cè)序技術(shù)。本研究就當(dāng)前該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀做一簡(jiǎn)要概述。

1 PCR陣列技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增技術(shù)（polymerase chain reaction，PCR）是目前應(yīng)用最廣的轉(zhuǎn)基因方法，包括定性PCR和定量PCR（quantitative PCR，qPCR）。多重PCR（multiplex PCR）可在同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增檢測(cè)2個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因序列，具備高通量檢測(cè)的潛質(zhì)。但由于多重qPCR之間的引物干擾，同時(shí)在1個(gè)反應(yīng)管中設(shè)計(jì)的多重qPCR最多5～6重，很難滿足實(shí)際檢測(cè)需求。

隨著轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積的激增和品種的日益豐富，檢測(cè)需求也隨之?dāng)U大，現(xiàn)有的檢測(cè)方法通量低、過程繁雜，很難滿足轉(zhuǎn)基因檢測(cè)需求。近年來基于qPCR的另一種策略逐步被關(guān)注和報(bào)道，即利用內(nèi)含特定引物組合的96孔或384孔預(yù)制板用于高通量轉(zhuǎn)基因篩查。預(yù)制板內(nèi)含有指定濃度的特異引物，形成規(guī)律性的矩陣，可同時(shí)用于同一模板DNA的多重檢測(cè)。該方法也被稱為實(shí)時(shí)定量PCR陣列/芯片法（real-time PCR array），結(jié)合已知的轉(zhuǎn)基因信息列表，這種轉(zhuǎn)基因檢測(cè)策略能夠有效地簡(jiǎn)化試驗(yàn)操作，增加檢測(cè)通量。

PCR陣列技術(shù)最早由歐盟聯(lián)合研究中心的研究人員于2009年建立。針對(duì)歐盟轉(zhuǎn)基因法規(guī)與檢測(cè)需求，依據(jù)Decision Support System與JRC GMO-Matrix中的信息，將各轉(zhuǎn)化體、外源基因與元件設(shè)計(jì)成最簡(jiǎn)化的檢測(cè)組合，利用歐盟驗(yàn)證的事件特異性定量PCR方法，可同時(shí)在7種作物中檢測(cè)39種轉(zhuǎn)化事件。這種策略能夠有效地增加檢測(cè)通量同時(shí)降低人為犯錯(cuò)的風(fēng)險(xiǎn)。后續(xù)的研究證明這種策略能夠有效地檢測(cè)加工食品與飼料產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分，在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中被迅速推廣和使用。

Mano等基于96孔預(yù)制板設(shè)計(jì)了可同時(shí)檢測(cè)15種轉(zhuǎn)基因玉米、4種轉(zhuǎn)基因大豆和2種轉(zhuǎn)基因油菜的qPCR陣列，共計(jì)包含21個(gè)事件特異性、13個(gè)外源插入基因和5個(gè)內(nèi)源基因，檢測(cè)低限LOD在0.01%～0.25%之間[2]。

Cottenet等基于384孔板整合了47套qPCR引物和探針，每個(gè)孔中進(jìn)行3重qPCR反應(yīng)，可同時(shí)檢測(cè)7個(gè)樣本中的47個(gè)靶標(biāo)基因，方法特異性良好，檢測(cè)低限LOD低于0.045%[3]。

歐盟聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室基于96孔板開發(fā)了最新版本的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)qPCR陣列，包含7個(gè)內(nèi)源基因、5個(gè)元件、1個(gè)構(gòu)建特異性和3個(gè)事件特異性，涵蓋80多個(gè)轉(zhuǎn)基因品系，可滿足同時(shí)檢測(cè)歐盟授權(quán)的全部轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物[4]。其中，96孔預(yù)制板由Eurogentec SA公司制作，檢測(cè)特異性由Life Technologies公司完成。該方法相對(duì)老版本有很大改進(jìn)，進(jìn)一步滿足了轉(zhuǎn)基因檢測(cè)需求[5-7]。

2 芯片技術(shù)

基因芯片（microarray）又稱DNA芯片（DNA microarray），是芯片技術(shù)中研究最早、最為成熟、應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)品。基因芯片技術(shù)通過固體在基質(zhì)表面的上千個(gè)特定探針，能夠一次性準(zhǔn)確地對(duì)樣品中不同種類的DNA序列進(jìn)行定性、定量篩查，具有高通量、集成化和自動(dòng)化的特點(diǎn)。相對(duì)核酸印跡雜交技術(shù)，基因芯片技術(shù)操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、檢測(cè)效率高，可應(yīng)用于基因突變檢測(cè)、多態(tài)性分析、基因表達(dá)譜測(cè)定、功能基因組研究等領(lǐng)域。

基因芯片技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的報(bào)道很多，相對(duì)PCR技術(shù)，芯片檢測(cè)的成本較高，但在檢測(cè)通量方面具備巨大優(yōu)勢(shì)。

Leimanis等開發(fā)了Silverquant芯片檢測(cè)方法用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，該方法利用硝酸鹽沉淀來檢測(cè)生物素化的擴(kuò)增產(chǎn)物，在靈敏度和可信度方面要優(yōu)于熒光染料;該方法覆蓋7個(gè)事件特異性、4個(gè)轉(zhuǎn)基因元件和5種內(nèi)源基因，LOD在0.03%～0.3%之間[8]。Tengs等設(shè)計(jì)了包含了約4萬個(gè)探針的Tilling芯片，涵蓋絕大多數(shù)植物轉(zhuǎn)化用的載體序列，可用于篩查未知轉(zhuǎn)化事件[9]。Hamels等評(píng)價(jià)了Eppendorf公司的DualChip轉(zhuǎn)基因檢測(cè)芯片，該產(chǎn)品可一次性進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn)，包含12個(gè)元件、7個(gè)植物內(nèi)源基因、11個(gè)事件特異性和6個(gè)control對(duì)照。該芯片可檢測(cè)到1%的植物成分、0.1%的GMO，準(zhǔn)確率大于95%[10]。Kim等針對(duì)19個(gè)轉(zhuǎn)化事件開發(fā)了DNA芯片，包含27個(gè)探針用于檢測(cè)內(nèi)源基因、35S啟動(dòng)子、事件特異性和內(nèi)源基因;其中事件特異性檢測(cè)包括2個(gè)GM大豆、13個(gè)GM玉米、3個(gè)GM油菜和1個(gè)GM棉花，方法檢測(cè)低限約為0.5%[11]。Lee開發(fā)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)芯片包含4個(gè)植物內(nèi)源基因、2個(gè)元件和7個(gè)外源基因（P35S、tNOS、pat、bar、epsps1、epsps2、pmi、cry1Ac和cry3B），方法特異性良好，靈敏度均可達(dá)到0.5%[12]。Turkec等針對(duì)3個(gè)GM大豆和9個(gè)GM玉米開發(fā)檢測(cè)芯片，共計(jì)設(shè)計(jì)了1 830個(gè)60 nt的探針，最終篩選出33個(gè)探針可用于區(qū)分12個(gè)GMO事件，并開發(fā)了1套數(shù)據(jù)算法來實(shí)現(xiàn)最大的檢測(cè)通量和靈敏度。作者利用該芯片可直接對(duì)土耳其市場(chǎng)流通的食品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度小于1%[13]。

3 高通量測(cè)序技術(shù)

近年來，以Roche/454、Illumina/Solexa和ABI/SOLiD為代表的高通量測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）極大地推動(dòng)了以動(dòng)物、植物和微生物為研究對(duì)象的生命科學(xué)研究[14-17]。相對(duì)于傳統(tǒng)DNA測(cè)序方法（Sanger法），NGS因其革命性的技術(shù)進(jìn)步，可在很短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)出千萬倍的測(cè)序數(shù)據(jù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)物種的基因組或轉(zhuǎn)錄組的整體覆蓋和全貌精細(xì)研究。目前以NGS技術(shù)為基礎(chǔ)的全基因組測(cè)序、基因組重測(cè)序、微生物宏基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、小分子RNA測(cè)序和表觀基因組測(cè)序等手段已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、食品、生態(tài)等多個(gè)研究領(lǐng)域。NGS技術(shù)革新了以基因?yàn)檠芯繉?duì)象的分子生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科研究，策略上實(shí)現(xiàn)了由釣魚式到撒網(wǎng)式的點(diǎn)到面的升級(jí)，極大地推動(dòng)了以基因組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)為代表的“組學(xué)”技術(shù)發(fā)展，使從全基因組尺度開展生命科學(xué)研究常態(tài)化[18-20]。

目前國(guó)內(nèi)外基于NGS技術(shù)開展轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的研究報(bào)道還比較少。Tengs等利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與差減計(jì)算的方法，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中發(fā)現(xiàn)了外源插入片段，理論上證明了NGS技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)[21]。但由于RNA的時(shí)空特異性表達(dá)與可變剪接等問題，使RNA的序列復(fù)雜度極高，直接導(dǎo)致該研究中基于RNA序列的差減分析存在大量的假陽性結(jié)果。Yang等利用NGS技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻T1c-19和TT51-1進(jìn)行的分子特征鑒定研究中指出，基于盲檢模型與20倍全基因組測(cè)序深度，只能部分識(shí)別外源DNA插入片段，并且結(jié)果中存在轉(zhuǎn)基因元件的假陽性判定[22]。

對(duì)于大片段轉(zhuǎn)基因的分子鑒定試驗(yàn)中，染色體步移策略是無法獲取全長(zhǎng)信息的，而NGS技術(shù)在轉(zhuǎn)基因分子鑒定領(lǐng)域具備強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)。Zhang等利用NGS技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因牛中的1個(gè)150 kb的人類乳鐵蛋白進(jìn)行了分子鑒定，一步獲得外源基因全長(zhǎng)序列、整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)等信息，結(jié)果通過了事件性PCR和FISH試驗(yàn)雜交驗(yàn)證[23]。

Barbau-piednoir等利用NGS技術(shù)對(duì)1個(gè)未授權(quán)的GM枯草桿菌進(jìn)行測(cè)序，通過Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)目的序列，然后設(shè)計(jì)引物用于事件性qPCR檢測(cè)。結(jié)果證明，這是有效的針對(duì)未授權(quán)GMO的檢測(cè)策略[24]。Fritsch等利用NGS技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米的純合性，結(jié)果證實(shí)NGS策略與qPCR相比更具優(yōu)勢(shì)，不需要試驗(yàn)步驟的優(yōu)化，統(tǒng)計(jì)學(xué)上也更加可靠[25]。Sahebi等對(duì)NGS技術(shù)在植物遺傳育種中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述指出，NGS能夠解決很多傳統(tǒng)辦法不能解決的問題，但同時(shí)大數(shù)據(jù)的安全存儲(chǔ)和繁雜的數(shù)據(jù)分析是對(duì)研究者的極大挑戰(zhàn)[26]。Willems等對(duì)NGS技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中的數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行了討論，作者以轉(zhuǎn)基因水稻為例進(jìn)行了測(cè)序和分析，提出了用于計(jì)算P值的公式和用于陽性結(jié)果認(rèn)定的算法，為NGS技術(shù)在GMO檢測(cè)中的應(yīng)用提供了量化標(biāo)準(zhǔn)[27]。

由于主流轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的基因組較大（例如大豆、玉米等），全基因組無差別測(cè)序需要很高的數(shù)據(jù)量才能實(shí)現(xiàn)有效的全基因組覆蓋深度，這直接導(dǎo)致了昂貴的測(cè)序成本、較高的生物信息學(xué)計(jì)算負(fù)荷和大量無法避免的假陽性結(jié)果。所以，全基因組無差別重測(cè)序策略很難實(shí)現(xiàn)有效的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，在測(cè)序之前增加特異性富集步驟十分必要。特異性的富集指定區(qū)段的DNA序列，而后再進(jìn)行深度測(cè)序能夠?qū)μ囟ǖ幕蚪M區(qū)域或感興趣的位點(diǎn)進(jìn)行針對(duì)性研究，相比于全基因組無差別測(cè)序，測(cè)序目的性更強(qiáng)，測(cè)序成本更低，是高效的NGS研究手段[28]。近年來逐步發(fā)展并不斷成熟的相關(guān)測(cè)序技術(shù)包括：外顯子組測(cè)序（whole exome sequencing，WES）[29]、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitaion，ChIP）[30]、降解組測(cè)序（degradome seuqencing）[31]、DNA甲基化測(cè)序（methylated DNA sequencing）[32]和酶切位點(diǎn)相關(guān)DNA測(cè)序（restriction-site associated DNA sequencing，RAD-seq）[33]等等。

在NGS測(cè)序之前先采取目的片段富集的策略，已在微生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域存在很多報(bào)道[34-36]。在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)領(lǐng)域，針對(duì)已知元件或外源基因的上下游序列進(jìn)行特異性富集，是利用NGS技術(shù)檢測(cè)（未授權(quán)）GMO的主要策略。目前按起始基因組DNA的打斷方式可分為3類：直接擴(kuò)增、隨機(jī)打斷和酶切特異性打斷。具體方法包括：（1）長(zhǎng)模版快速擴(kuò)增基因組DNA末端法（long template-rapid amplification of genomic DNA ends，LT-RADE），該方法由RACE技術(shù)演化而來，先利用特異性引物單向外擴(kuò)，PolyC加尾后再用巢式引物擴(kuò)增，可獲得插入位點(diǎn)的上下文序列[37];（2）線性擴(kuò)增介導(dǎo)的PCR法（linear amplification-mediated PCR，LAM-PCR），該方法利用生物素標(biāo)記特異探針，可以利用磁珠富集一鏈cDNA，使用隨機(jī)引物獲得二鏈cDNA后，連接接頭再進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增可獲得目標(biāo)片段[38];（3）非限制性線性擴(kuò)增介導(dǎo)的PCR法（nonrestrictive linear amplification-mediated PCR，nrLAM-PCR），該方法是LAM-PCR的變種，其中二鏈cDNA并不合成，直接使用單鏈DNA接頭連接一鏈cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增，該方法的缺點(diǎn)是單鏈DNA連接效率較低[35];（4）位點(diǎn)特異PCR法（SiteFinding-PCR），該方法屬于半隨機(jī)引物擴(kuò)增策略，直接利用基因組上的特異序列與基因特異引物配對(duì)，可直接擴(kuò)增獲得目的片段，一般獲得序列長(zhǎng)短不一[39];（5）座位特異PCR法（locus-finding PCR，LF PCR），該方法與SiteFinding-PCR方法類似，但在巢式PCR富集步驟中利用已知序列設(shè)計(jì)接頭用于磁珠富集以提高效率，缺點(diǎn)是該方法只能單向擴(kuò)增獲得一側(cè)序列，一般序列長(zhǎng)度小于500 bp[40];（6）高通量的插入追蹤測(cè)序法（high-throughput insertion tracking by deep sequencing，HITS），該方法先片段化基因組DNA，經(jīng)末端修復(fù)后連接測(cè)序接頭，再結(jié)合基因特異引物可擴(kuò)增插入位點(diǎn)的邊界序列[36];（7）隨機(jī)片段PCR擴(kuò)增法（randomly broken fragment PCR，RBF-PCR），該方法與HITS類似，基因組DNA片段化后加PolyA尾，全部連接測(cè)序“Y”形接頭，再經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增后可獲得目標(biāo)序列[41];（8）AT接頭法（AT-linker PCR），基因組DNA經(jīng)酶切片段化后加A尾，再利用特異引物與OligodT復(fù)合引物配對(duì)可擴(kuò)增目的片段[42];（9）環(huán)狀接頭法（loop-linker PCR），該方法與AT接頭法類似，酶解基因組DNA后直接使用帶黏性末端的環(huán)狀接頭與之連接，再經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增可獲得目的片段[43];（10）TOPO載體連接PCR法（TOPO vector ligation PCR），該方法與A-T linker法類似，但使用一個(gè)平末端載體來代替A-T linker，使用載體的上引物與目的基因特異引物配對(duì)，可擴(kuò)增目的片段[44];（11）探針雜交測(cè)序法（Southern-by-Sequencing，SbS），利用已知目標(biāo)序列設(shè)計(jì)～70 nt探針，用于雜交富集DNA片段再測(cè)序，該方法不需要PCR擴(kuò)增，但必須要預(yù)制插入位點(diǎn)附近的序列，不適用于未知轉(zhuǎn)基因檢測(cè)[45-46]。

總的來說，目前NGS技術(shù)在GMO檢測(cè)上的應(yīng)用還很有限，DNA富集策略必須依賴預(yù)知元件，還沒有非常便捷、低成本的靶標(biāo)富集方法。GM檢測(cè)一般需要0.1%的靈敏度和高通量需求，最好能夠分析混合物種樣本（例如玉米和大豆混樣），要想實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)要求，NGS技術(shù)還需要在低成本、高效和寬靶標(biāo)等方向有所進(jìn)步。NGS技術(shù)為GM檢測(cè)打開了新的大門，雖然還存在很多技術(shù)瓶頸，但可以預(yù)見在不久的未來，隨著測(cè)序成本的不斷下降，NGS技術(shù)必將成為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)領(lǐng)域的主流技術(shù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]ISAAA. Global status of commercialized Biotech/GM crops：2016[J]. ISAAA Brief，2016（52）.

[2]Mano J，Harada M，Takabatake R，et al. Comprehensive GMO detection using real-time PCR array：single-laboratory validation[J]. Journal of AOAC International，2012，95（2）：508-516.

[3]Cottenet G，Blancpain C，Sonnard V，et al. Development and validation of a multiplex real-time PCR method to simultaneously detect 47 targets for the identification of genetically modified organisms[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2013，405（21）：6831-6844.

[4]Rosa S F，Gatto F，Angers-Loustau A，et al. Development and applicability of a ready-to-use PCR system for GMO screening[J]. Food Chemistry，2016，201（1）：110-119.

[5]Querci M，F(xiàn)oti N，Bogni A，et al. Real-time PCR-based ready-to-use multi-target analytical system for GMO detection[J]. Food Analytical Methods，2009，2（4）：325-336.

[6]Kluga L，Bulcke M V D，F(xiàn)olloni S，et al. A ready-to-use multi-target analytical system for GM soy and maize detection for enforcement laboratories：INTECH Open Access Publisher[J]. Soybean-Applications，2011，3（4）：225-240

[7]Kluga L，F(xiàn)olloni S，Bulcke M V D，et al. Applicability of the “real-time PCR-based ready-to-use multi-target analytical system for GMO detection” in processed maize matrices[J]. European Food Research and Technology，2012，234（1）：109-118.

[8]Leimanis S，Hernandez M，F(xiàn)ernandez S，et al. A microarray-based detection system for genetically modified （GM） food ingredients[J]. Plant Molecular Biology，2006，61（1/2）：123-139.

[9]Tengs T，Kristoffersen AB，Berdal KG，et al. Microarray-based method for detection of unknown genetic modifications[J]. BMC biotechnology，2007，7（1）：91.

[10]Hamels S，Leimanis S，Mazzara M，et al. Microarray method for the screening of EU approved GMOs by identification of their genetic elements[R/OL]. Eurpean Commission：Joint Research Centre. Italia，2007[2017-08-20]. http：//biotech jrc it/home/docs htm.

[11]Kim J H，Kim S Y，Lee H，et al. An event-specific DNA microarray to identify genetically modified organisms in processed foods[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（10）：6018-6026.

[12]Lee S H. Screening DNA chip and event‐specific multiplex PCR detection methods for biotech crops[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2014，94（14）：2856-2862.

[13]Turkec A，Lucas S J，Karacanli B，et al. Assessment of a direct hybridization microarray strategy for comprehensive monitoring of genetically modified organisms（GMOs）[J]. Food Chemistry，2016，194（3）：399-409.

[14]Meyer M，Stenzel U，Hofreiter M. Parallel tagged sequencing on the 454 platform[J]. Nature Protocols，2008，3（2）：267-278.

[15]Quail M A，Kozarewa I，Smith F，et al. A large genome centers improvements to the Illumina sequencing system[J]. Nature Methods，2008，5（12）：1005-1010.

[16]Turcatti G，Romieu A，F(xiàn)edurco M，et al. A new class of cleavable fluorescent nucleotides：synthesis and optimization as reversible terminators for DNA sequencing by synthesis[J]. Nucleic Acids Research，2008，36（4）：26-40.

[17]Housby J N，Southern E M. Fidelity of DNA ligation：a novel experimental approach based on the polymerisation of libraries of oligonucleotides[J]. Nucleic Acids Res，1998，26（18）：4259-4266.

[18]Mardis E R. The impact of next-generation sequencing technology on genetics[J]. Trends in Genetics，2008，24（3）：133-141.

[19]Schuster S C. Next-generation sequencing transforms todays biology[J]. Nature Methods，2008，5（1）：16-18.

[20]Shendure J，Ji H. Next-generation DNA sequencing[J]. Nature Biotechnology，2008，26（10）：1135-1145.

[21]Butenko M A，Jon B，Arne H J，et al. Characterization of unknown genetic modifications using high throughput sequencing and computational subtraction[J]. BMC Biotechnology，2009，9（1）：87.

[22]Yang L，Wang C，Holst-Jensen A，et al. Characterization of GM events by insert knowledge adapted re-sequencing approaches[J]. Scientific Reports，2013，3（5）：115-131.

[23]Zhang R，Yin Y，Zhang Y，et al. Molecular characterization of transgene integration by next-generation sequencing in transgenic cattle[J]. PLoS One，2012，7（11）：50348-50368.

[24]Barbau-piednoir E，de Keersmaecker S C，Delvoye M，et al. Use of next generation sequencing data to develop a qPCR method for specific detection of EU-unauthorized genetically modified Bacillus subtilis overproducing riboflavin[J]. BMC Biotechnology，2015，15（1）：103.

[25]Fritsch L，F(xiàn)ischer R，Wambach C，et al. Next-generation sequencing is a robust strategy for the high-throughput detection of zygosity in transgenic maize[J]. Transgenic Research，2015，24（4）：615-623.

[26]Sahebi M，Hanafi M M，Azizi P，et al. Suppression subtractive hybridization versus next-generation sequencing in plant genetic engineering：challenges and perspectives[J]. Molecular Biotechnology，2015，57（10）：880-903.

[27]Willems S，F(xiàn)raiture M A，Deforce D，et al. Statistical framework for detection of genetically modified organisms based on next generation sequencing[J]. Food Chemistry，2016，192：788-798.

[28]Metzker M L. Sequencing technologies - the next generation[J]. Nature Reviews Genetics，2010，11（1）：31-46.

[29]Ng S B，Turner E H，Robertson P D，et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes[J]. Nature，2009，461（7261）：272-306.

[30]Wang X，Elling A A，Li X，et al. Genome-wide and organ-specific landscapes of epigenetic modifications and their relationships to mRNA and small RNA transcriptomes in maize[J]. The Plant Cell Online，2009，21（4）：1053-1069.

[31]German M A，Pillay M，Jeong D H，et al. Global identification of microRNA-target RNA pairs by parallel analysis of RNA ends[J]. Nature Biotechnology，2008，26（8）：941-946.

[32]Li N，Ye M，Li Y，et al. Whole genome DNA methylation analysis based on high throughput sequencing technology[J]. Methods，2010，52（3）：203-212.

[33]Baird N A，Etter P D，Atwood T S，et al. Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers[J]. PLoS One，2008，3（10）：e3376.

[34]Volpicella M，Leoni C，Costanza A，et al. Genome walking by next generation sequencing approaches[J]. Biology，2012，1（3）：495-507.

[35]Gabriel R，Eckenberg R，Paruzynski A，et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy[J]. Nature Medicine，2009，15（12）：1431-1456.

[36]Gawronski J D，Wong S M，Giannoukos G，et al. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106（38）：16422-16467.

[37]Spalinskas R，van den Bulcke M，van den Eede G，et al. LT-RADE：an efficient user-friendly genome walking method applied to the molecular characterization of the insertion site of genetically modified maize MON810 and rice LLRICE62[J]. Food Analytical Methods，2013，6（2）：705-755.

[38]Schmidt M，Zickler P，Hoffmann G，et al. Polyclonal long-term repopulating stem cell clones in a primate model[J]. Blood，2002，100（8）：2737-2774.

[39]Tan G，Gao Y，Shi M，et al. SiteFinding-PCR：a simple and efficient PCR method for chromosome walking[J]. Nucleic Acids research，2005，33（13）：122-145.

[40]Thirulogachandar V，Pandey P，Vaishnavi C S，et al. An affinity-based genome walking method to find transgene integration loci in transgenic genome[J]. Analytical Biochemistry，2011，416（2）：196-201.

[41]Xu W，Shang Y，Zhu P，et al. Randomly broken fragment PCR with 5′ end-directed adaptor for genome walking[J]. Scientific Reports，2013，34（15）：115-135.

[42]Trinh Q，Xu W，Shi H，et al. An AT linker adapter polymerase chain reaction method for chromosome walking without restriction site cloning bias[J]. Analytical Biochemistry，2012，425（1）：62-85.

[43]Trinh Q，Shi H，Xu W，et al. Loop‐linker PCR：an advanced PCR technique for genome walking[J]. IUBMB Life，2012，64（10）：841-845.

[44]Kanizay L B，Jacobs T B，Gillespie K，et al. Parrott WA. HtStuf：High-throughput sequencing to locate unknown DNA junction fragments[J]. The Plant Genome，2015，8（1）：67-98

[45]Lepage E′，Zampini E′，Boyle B，et al. Time-and cost-efficient identification of T-DNA insertion sites through targeted genomic sequencing[J]. PLoS One，2013，8（8）：70912-70935.

[46]Zastrow-Hayes G M，Lin H，Sigmund A L，et al. Southern-by-sequencing：a robust screening approach for molecular characterization of genetically modified crops[J]. The Plant Genome，2015，8（1）：25-49.