不同種屬來源活化體系中CYP2A6 酶活及其對(duì)煙堿代謝的動(dòng)力學(xué)

王蕙婷，李 翔，華辰鳳，許良濤，趙 閣，尚平平，喬梁峻，趙俊偉，劉惠民，彭桂新，謝復(fù)煒*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 450001

2. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)第三大街8 號(hào) 450000

CYP2A6 作為細(xì)胞色素P450 酶家族中的一員，主要表達(dá)于肝臟，約占細(xì)胞色素P450 的5%，主要參與煙堿及臨床上常用的藥物如甲硝唑、替加氟等的代謝［1-2］，也在煙草特有亞硝胺NNK 和NNN 的代謝活化中起至關(guān)重要的作用［3］。煙堿是卷煙煙氣中的重要活性成分，燃吸煙草時(shí)釋放出的煙堿可使吸煙者的植物神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到刺激，吸煙者通過攝入煙堿來維持血、腦中的煙堿水平，形成吸煙依賴行為［4-6］，因此，煙堿是煙草依賴形成和維持的主要驅(qū)動(dòng)力。研究表明，人體內(nèi)約70%～80%的煙堿通過CYP2A6 催化的反應(yīng)被代謝成可替寧［7］（圖1）。首先，CYP2A6 介導(dǎo)煙堿C-氧化為煙堿△1′（5′）-亞銨離子，再經(jīng)細(xì)胞質(zhì)醛氧化酶氧化成可替寧，可替寧再由CYP2A6 進(jìn)一步催化形成反式-3′-羥基可替寧、5′-羥基可替寧和去甲可替寧。上述代謝途徑表明，CYP2A6 是煙堿的主要代謝酶。研究發(fā)現(xiàn)，CYP2A6 活性在不同個(gè)體之間存在較大差異［8］，且與正常吸煙者相比，CYP2A6 活性較低的吸煙者每天消費(fèi)卷煙數(shù)量更少，體內(nèi)較高的CYP2A6 酶活會(huì)使吸煙者消費(fèi)卷煙量變大，暴露于更高濃度的致癌物中，從而導(dǎo)致肺癌風(fēng)險(xiǎn)增高［9-10］。因此該酶活性水平直接影響體內(nèi)煙堿代謝速率及個(gè)體吸煙行為，從而導(dǎo)致暴露風(fēng)險(xiǎn)變化［11-12］。

不同種屬間的藥物代謝差異一直是藥物研發(fā)的重點(diǎn)。有研究報(bào)道，不同種屬對(duì)香豆素的代謝能力不同，表明CYP2A6 在種屬間的表達(dá)存在顯著差異［13-14］，且CYP2A6 酶的基因是高度多態(tài)性的，迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了40 多種變異，不同基因型的CYP2A6 酶活存在著明顯差異［15-17］，這些差異均可導(dǎo)致研究結(jié)果不同。目前國內(nèi)外關(guān)于CYP2A6 酶活的報(bào)道主要集中于不同人群的CYP2A6 遺傳表型及其與吸煙行為、相關(guān)癌癥發(fā)病率的相關(guān)性研究［18-20］，關(guān)于該酶在體外藥物代謝模型應(yīng)用方面的研究較少。有研究人員使用不同動(dòng)物的肝微粒體或同源重組人工酶進(jìn)行體外藥物代謝研究［21-22］，但不同種屬間CYP2A6 酶蛋白表達(dá)水平及酶活性差異尚不明確。所以，在體外條件下探究不同來源活化體系中的CYP2A6 酶活對(duì)卷煙煙氣的體外毒理學(xué)研究具有重要意義。因此，本研究中選取CYP2A6 重組酶、不同來源的人肝微粒體及藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的動(dòng)物肝微粒體等進(jìn)行CYP2A6 酶體外活性研究，以期為煙堿的體外毒理學(xué)評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)支撐。

圖1 煙堿主要代謝通路：由CYP2A6 及醛氧化酶依次催化成可替寧Fig.1 Metabolic pathway for nicotine catalyzed by CYP2A6 and aldehyde oxidase successively to cotinine

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、HepG2 細(xì)胞（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）；CYP2A6 重組酶（EZ011）（0.5 mL，10 mg/mL）、無表達(dá)對(duì)照蛋白（EZ003）（0.5 mL，10 mg/mL）（英國Cypex 公司）；25 供體混合性別人肝微粒體（X008064）（0.5 mL，20 mg/mL）、雄性SD大鼠（混合）肝微粒體（0.5 mL，20 mg/mL）、雄性恒河猴（混合）肝微粒體（0.5 mL，20 mg/mL）、雄性比格犬（混合）肝微粒體（0.5 mL，20 mg/mL）、雄性SD 大鼠（混合）肝S9（0.5 mL，20 mg/mL）（美國BioIVT 公司）；男性混合人肝微粒體（0.5 mL，20 mg/mL）、NADPH 發(fā)生系統(tǒng)（匯智泰康生物技術(shù)有限公司）。

支氣管上皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Bronchial epithelial cell basal medium，BEBM）、SingleQuots 細(xì)胞因子（CC-3171，Clonetics）（美國Lonza 公司）；改良Eagle 培養(yǎng)基（Dulbecco's modified of eagle's medium，DMEM）、胎牛血清、青鏈霉素混合液（生化級(jí)，美國Gibco 公司）；胰酶（500 U/mg，美國Amresco 公司）；甲酸銨（色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)技術(shù)股份有限公司）；煙堿、煙堿-d3（NIC-d3）（色譜純，加拿大TRC 試劑公司）；氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、七水合磷酸氫二鈉（AR，天津凱通化學(xué)試劑有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，生化級(jí)，美國Amresco 公司）；乙腈（色譜純，美國J&T Baker 公司）；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品（26617，美國Thermo Scientific 公司）；兔抗一抗β-actin（ab8227）、兔抗一抗 GADPH（ab181602）、兔 抗 一 抗 CYP2A6（ab3570）（英國Abcam 公司）；辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔二抗、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（Enhanced chemiluminescence，ECL）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；哺乳動(dòng)物蛋白提取試劑（Mammalian protein extraction reagent，78501，美國Thermo 公司）。

HERA Cell 240 細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)（江蘇省蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)皿（430166，美國Corning 公司）；TH4-200 顯微鏡（日本Olympus 公司）；Nanodrop 2000 超微量紫外分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（美 國Merck Millipore 公司）；AL204-IC 電子天平（感量0.000 1 g，瑞 士Mettler Toledo 公 司）；Mini Trans-Blot Electrophoreti 蛋白免疫印跡小型Trans-Blot 轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-Rad 公司）；Fluor Chem E 超靈敏全自動(dòng)成像分析系統(tǒng)（美國Protein Simple 公司）；3-18K高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；13 mm×0.22 μm有機(jī)相針式濾膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q 超純水純化系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；1200 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；API 4000 液相色譜/質(zhì)譜（HPLC/MS）聯(lián)用儀（美國AB SCIEX 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1.1 貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)

將BEAS-2B 細(xì)胞接種于含有BEBM 細(xì)胞培養(yǎng)基（加SingleQuots 細(xì)胞因子）的10 cm 培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，在細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)到80%后，用0.05%（體積百分比）胰酶消化，離心，棄去上清液；加入新鮮培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

HepG2 細(xì)胞所用培養(yǎng)基為含有10%（體積百分比）胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，0.25%（體積百分比）胰酶消化，培養(yǎng)方法同上。

1.2.1.2 懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)

將巨噬細(xì)胞接種于含有10%（體積百分比）胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，在細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，離心，棄上清液，加入新鮮的培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，傳代并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2.2 免疫印跡法測(cè)定各體系中CYP2A6 蛋白表達(dá)水平

采用1.2.1 節(jié)所述方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，收獲細(xì)胞于冰上裂解得到細(xì)胞全蛋白，肝微粒體及重組酶可解凍后直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量全蛋白濃度，調(diào)整電泳上樣量均為20 μg 蛋白。制備5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的濃縮膠和8%～15%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離膠并對(duì)蛋白樣品進(jìn)行分離。使用轉(zhuǎn)膜裝置將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上（轉(zhuǎn)膜電壓100 V，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1 h）。將PVDF 膜于5%的脫脂奶粉溶液中室溫封閉1 h，使用含Tween 20（0.05%）的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（Tris-buffered saline and Tween 20，TBST）洗膜3 次，每次5 min，后與相對(duì)應(yīng)的兔抗一抗于4 ℃下孵育過夜。次日使用TBST 洗膜3 次，每次5 min，后與HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗于室溫中孵育1 h。使用TBST 洗膜3 次，每次5 min。然后使用ECL 進(jìn)行顯影，使用顯影儀拍照。

1.2.3 煙堿代謝孵育方法

用KH2PO4緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）將各體系蛋白液稀釋至一定濃度，各反應(yīng)體系為0.2 mL。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定精密量取煙堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入反應(yīng)體系中，37 ℃預(yù)孵育5 min 后，立即加入NADPH 發(fā)生系統(tǒng)啟動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)一定時(shí)間后，加入等體積含內(nèi)標(biāo)的乙腈終止反應(yīng)，然后將孵育液渦旋3 min，4 ℃、13 000 r/min 離心20 min，取上清液過濾，進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析。以無表達(dá)對(duì)照蛋白組的孵育體系為陰性對(duì)照。進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.1 煙堿在各體系中的穩(wěn)定代謝

孵育體系為0.2 mL，包含KH2PO4緩沖液、各活化體系（蛋白濃度0.5 g/L）、煙堿（200 ng/mL），37 ℃水浴中預(yù)孵育5 min 后，加入同法預(yù)孵的NADPH 溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，繼續(xù)于37 ℃水浴中孵育，并分別于0、5、10、15、30、45、60 min 取出，立即加入等體積含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液終止反應(yīng)。將孵育液渦旋3 min，13 000 r/min 離心20 min，取上清液過濾，進(jìn)樣檢測(cè)剩余煙堿的濃度。

1.2.3.2 目標(biāo)代謝體系對(duì)煙堿的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

A. 不同蛋白濃度下煙堿的代謝-時(shí)間曲線

根據(jù)穩(wěn)定性代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定目標(biāo)體系，將CYP2A6 重組酶代謝活化體系的蛋白終濃度調(diào)節(jié)為系列濃度（0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL），將雄性恒河猴（混合）肝微粒體及25 供體混合性別人肝微粒體代謝活化體系的蛋白終濃度均調(diào)節(jié)為系列濃度（0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 mg/mL）。孵育體系中煙堿初始濃度為8 μg/mL。在37 ℃預(yù)孵育5 min 后，立即加入NADPH 溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，每個(gè)濃度樣品分別在孵育0、5、10、20、30、60、120 min 后用等體積含內(nèi)標(biāo)的乙腈終止反應(yīng)，每個(gè)蛋白濃度及時(shí)間點(diǎn)平行操作3 管。對(duì)樣品處理后進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析。以孵育后的底物濃度對(duì)孵育時(shí)間作圖。

B. 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

根據(jù)1.2.3.2 節(jié)A 項(xiàng)下方法所得結(jié)果，確定線性范圍內(nèi)的孵育時(shí)間點(diǎn)和蛋白濃度點(diǎn)，在此條件下測(cè)定酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在最佳蛋白濃度下的各體系中，分別加入不同濃度的煙堿，使其在孵育體系中的初始濃度分別為1、2、4、8、16、32、64 μg/mL，37 ℃預(yù)孵育5 min，加入NADPH 啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃孵育至最佳孵育時(shí)間后，加入等體積含內(nèi)標(biāo)的乙腈終止反應(yīng)，13 000 r/min 離心20 min，取上清液過濾后進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析，測(cè)定剩余煙堿的濃度，每個(gè)底物濃度平行操作3 管，按照Lineweaver Burk法計(jì)算米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax）［23］。

1.2.4 HPLC-MS/MS 檢測(cè)方法

將得到的樣品用濾膜過濾處理后進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析，分析條件：

色譜柱：Waters×Bridge C18柱（2.1 mm×150 mm，5.0 μm）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.30 mL/min；流動(dòng)相：A 水（10 mmol/L 甲酸銨，用甲酸調(diào)節(jié)pH=3.0），B 乙腈，梯度洗脫（0～11 min，5%～70% A；11～13 min，70%～5% A；13～16 min，5% A）；進(jìn)樣前，色譜柱平衡16 min。離子源：電噴霧電離（ESI）；掃描模式：正離子掃描；碰撞氣（CAD，N2）：41.37 kPa（6 psi）；霧化氣（GS1，N2）：344.75 kPa（50 psi）；輔助加熱氣（GS2，N2）：344.75 kPa（50 psi）；氣 簾 氣（CUR，N2）：68.95 kPa（10 psi）；電噴霧電壓：5 000 V；干燥溫度：500 ℃；掃描時(shí)間：40 ms；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表 征。 采 用Graphpad Prism 5.0 軟 件（美 國GraphPad 軟件有限公司）進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析。使用SPSS 13.0 軟件（美國SPSS 公司）對(duì)數(shù)據(jù)組間差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用單因素方差分析法（One-way analysis of variance，ANOVA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行最小顯著差異（Least significant difference，LSD）檢驗(yàn)。P＜0.05 時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 各體系中CYP2A6 蛋白表達(dá)水平

采用免疫印跡法檢測(cè)相同蛋白上樣量（20 μg）中各活化體系中CYP2A6 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖2 所示，由HepG2 細(xì)胞、BEAS-2B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞（1、2 和3）中內(nèi)參蛋白β-actin 與GADPH 的表達(dá)水平基本一致可判斷免疫印跡實(shí)驗(yàn)中每組樣品蛋白上樣量一致。β-Actin 及GAPDH 廣泛表達(dá)于細(xì)胞漿中［24-25］，而重組酶在大腸桿菌中表達(dá)提取，故4 號(hào)體系中無內(nèi)參蛋白表達(dá)。肝S9 由肝組織勻漿取上清液后制得，主要成分為微粒體和胞質(zhì)組分，肝微粒體只含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)亞細(xì)胞組分［26］，二者的制備過程均發(fā)生內(nèi)參蛋白量的改變。所以內(nèi)參蛋白β-actin 與GADPH 的表達(dá)水平在各體系中存在差異。因此，本研究中采用分光光度計(jì)調(diào)整各體系蛋白上樣量均為20 μg，進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。由圖2 可知，與陰性對(duì)照組相比，CYP2A6 重組酶（以下簡(jiǎn)稱重組酶）中CYP2A6 蛋白表達(dá)水平較高，25供體混合性別人肝微粒體（以下簡(jiǎn)稱25 供體人肝微粒體）及男性混合人肝微粒中均有少量表達(dá)。由于該酶主要在肝臟表達(dá)，在呼吸系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)表達(dá)較少且存在較大的個(gè)體差異性［27-31］，故在BEAS-2B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中均未檢測(cè)到CYP2A6蛋白。而HepG2 細(xì)胞屬于肝腫瘤細(xì)胞，其藥物代謝酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常肝細(xì)胞［32］，因而在HepG2細(xì)胞中也未檢測(cè)到CYP2A6 蛋白。由于種屬差異，CYP2A6 酶在猴肝部的表達(dá)水平較高，而在犬肝部幾乎不表達(dá)［33］，故本實(shí)驗(yàn)中雄性恒河猴（混合）肝微粒體（以下簡(jiǎn)稱猴肝微粒體）中CYP2A6蛋白表達(dá)水平明顯高于雄性比格犬（混合）肝微粒體（以下簡(jiǎn)稱犬肝微粒體）。關(guān)于CYP2A6 酶在大鼠體內(nèi)的表達(dá)，有報(bào)道證明大鼠肝微粒體內(nèi)含有CYP2A6 酶［34］，也有研究認(rèn)為CYP2A6 酶于大鼠肝微粒體幾乎不表達(dá)［33］，故于雄性SD 大鼠（混合）肝微粒體（以下簡(jiǎn)稱大鼠肝微粒體）檢測(cè)到少量的CYP2A6 蛋白，而不同來源的雄性SD 大鼠（混合）肝S9（以下簡(jiǎn)稱大鼠肝S9）中則未檢測(cè)到該蛋白。免疫印跡法測(cè)得的結(jié)果反映了各體系中CYP2A6 蛋白表達(dá)水平的高低，而各體系中CYP2A6 實(shí)際酶活性高低還需后續(xù)的代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。

圖2 免疫印跡法測(cè)定各體系中的CYP2A6 蛋白表達(dá)水平Fig.2 Determination of CYP2A6 protein expression levels by immunoblotting

2.2 煙堿在各體系中的代謝穩(wěn)定性

為了比較各活化體系對(duì)煙堿代謝能力的差異，分別在各體系中進(jìn)行低濃度煙堿穩(wěn)定代謝實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明不同體系對(duì)煙堿的代謝能力不同。從煙堿的穩(wěn)定代謝曲線（圖3a）可知，在各體系（蛋白濃度均為0.5 mg/mL）中，煙堿在30 min 內(nèi)代謝較快，30～60 min 內(nèi)剩余底物的濃度變化較小，趨于穩(wěn)定。通過各體系在孵育2 h 后的煙堿代謝率（圖3b），可更為直觀地比較各體系對(duì)煙堿代謝能力的差異，且結(jié)合2.1 節(jié)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各體系煙堿代謝率與其CYP2A6 蛋白表達(dá)水平基本一致，其中，HepG2、BEAS-2B 及巨噬細(xì)胞中CYP2A6 蛋白表達(dá)水平及煙堿代謝能力最低，重組酶及猴肝微粒體中的CYP2A6 蛋白表達(dá)水平最高，對(duì)煙堿代謝能力最強(qiáng)。在CYP2A6 蛋白表達(dá)水平均較低的情況下，25 供體人肝微粒體的煙堿代謝能力明顯高于男性混合肝微粒體及其他CYP2A6 蛋白表達(dá)水平相近的體系；免疫印跡結(jié)果表明，大鼠肝S9 中CYP2A6 表達(dá)水平明顯低于大鼠肝微粒體及犬肝微粒體，但三者CYP2A6 酶中煙堿代謝率均約為10%。這些差異表明，除酶蛋白表達(dá)水平外，種屬、性別及基因型的不同對(duì)代謝能力也存在顯著影響［14,16,35］。通過比較CYP2A6 蛋白表達(dá)水平及其對(duì)煙堿代謝率發(fā)現(xiàn)，各體系中CYP2A6 酶活存在顯著差異。CYP2A6 酶活高低對(duì)于卷煙煙氣的其他成分的代謝活化過程是否有影響還需要進(jìn)一步討論。

圖3 不同體系對(duì)煙堿代謝能力的比較Fig.3 Metabolic activity of nicotine in different systems

2.3 目標(biāo)代謝體系對(duì)煙堿的代謝-時(shí)間曲線

按照1.2.3.2 節(jié)A 項(xiàng)下的方法測(cè)得數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步探究各體系實(shí)際酶活性，將煙堿代謝率最高的3 個(gè)體系（CYP2A6 重組酶、猴肝微粒體及25 供體人肝微粒體）作為目標(biāo)體系進(jìn)行代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定。以不同孵育時(shí)間對(duì)目標(biāo)體系中剩余煙堿濃度繪制不同蛋白濃度下的孵育時(shí)間曲線（圖4）。由不同蛋白濃度下重組酶代謝-時(shí)間曲線（圖4a）可知，當(dāng)重組酶蛋白濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，孵育10 min 內(nèi)有良好線性。表明在測(cè)定CYP2A6 重組酶的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)時(shí)，應(yīng)使用0.5 mg/mL 的蛋白濃度，與煙堿共孵育10 min。由25 供體人肝微粒體的代謝-時(shí)間曲線（圖4b）分析可知，在孵育時(shí)間10 min 內(nèi)，1.0 mg/mL 及1.5 mg/mL 蛋白濃度下的孵育時(shí)間曲線較為接近，且均具有良好的線性，在滿足代謝現(xiàn)象明顯且盡量降低體系蛋白濃度的原則下，25 供體人肝微粒體的最佳孵育條件為蛋白濃度1.0 mg/mL，孵育10 min?；诖嗽瓌t分析猴肝微粒體（圖4c）的代謝-時(shí)間曲線，可得其孵育條件應(yīng)設(shè)置為蛋白濃度1.0 mg/mL、孵育10 min。

圖4 不同蛋白濃度下各目標(biāo)體系的煙堿代謝-時(shí)間曲線Fig.4 Metabolic-time curves of nicotine in target systems at different protein concentrations

2.4 目標(biāo)代謝體系對(duì)煙堿代謝的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

因動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定需要確定該體系對(duì)底物的最佳孵育時(shí)間及酶濃度，即其代謝-時(shí)間曲線在線性范圍內(nèi)的孵育時(shí)間及蛋白濃度，從而在此條件下進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定。故由2.3 節(jié)的代謝-時(shí)間曲線可得，重組酶、25 供體人肝微粒體及猴肝微粒體的最佳線性孵育蛋白濃度分別為0.5、1.0、1.0 mg/mL，最佳線性孵育時(shí)間均為10 min。在此條件下測(cè)定系列煙堿濃度下的煙堿代謝速度，并以煙堿代謝速度與其初濃度做濃度孵育曲線（圖5）。計(jì)算的3 個(gè)體系的Km值和Vmax值結(jié)果如表1 所示。

代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明，重組酶及猴肝微粒體中CYP2A6 酶的Km及Vmax值較為接近，25 供體人肝微粒體中CYP2A6 酶Km及Vmax值較低。較低的Km值表明該CYP2A6 酶對(duì)煙堿代謝親和力強(qiáng)。結(jié)合免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，重組酶及猴肝微粒體中CYP2A6 酶Vmax值基本與其酶蛋白表達(dá)水平正相關(guān)。而在25 供體人肝微粒體中，CYP2A6 蛋白表達(dá)水平較低，但Vmax值與CYP2A6 重組酶及猴肝微粒體較為接近，該結(jié)果表明25 供體人肝微粒體中CYP2A6 的酶活顯著高于CYP2A6 重組酶及猴肝微粒體。這種酶活性的差異與其種屬有關(guān)［14］。綜合比較各目標(biāo)體系，25 供體人肝微粒體及猴肝微粒體不僅對(duì)煙堿代謝活性較高，且均富含大量的P450 酶及其他代謝酶［36-39］，在體外藥物代謝研究領(lǐng)域中應(yīng)用范圍較廣。而同源重組CYP2A6 酶的活性最高，在煙堿的體外代謝研究及煙氣的體外毒性評(píng)價(jià)中具有較強(qiáng)的適用性。但與肝微粒體體系相比，酶種類單一，且代謝機(jī)制仍需進(jìn)一步探索研究。

圖5 線性條件下各目標(biāo)體系的煙堿濃度-孵育曲線Fig.5 Incubation curves of nicotine in target systems under optimum linear conditions

表1 各體系代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.1 Metabolic kinetic parameters of target systems

3 結(jié)論

①10 種活化體系中CYP2A6 酶活具有明顯差異，煙堿在與25 供體混合性別人肝微粒體、同源重組CYP2A6 酶及雄性恒河猴肝微粒體共孵育時(shí)其濃度明顯降低，而另外7 種則無CYP2A6 活性或活性較低。 ②CYP2A6 的蛋白表達(dá)水平與CYP2A6 酶活具有一定的相關(guān)性，對(duì)目標(biāo)活化體系進(jìn)行CYP2A6 蛋白相對(duì)定量及代謝動(dòng)力學(xué)研究可為煙氣體外毒理學(xué)評(píng)價(jià)中代謝活化體系的篩選提供依據(jù)。