脫細胞生物支架的研究進展

范志強，劉雯恩，周艷芳，李玉玲，楊家華，彭新生

(廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 廣東省東莞市藥物設(shè)計與制劑技術(shù)重點實驗室 生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心醫(yī)藥新材料研究與開發(fā)重點實驗室，廣東 東莞 523808)

生物支架的定義尚不統(tǒng)一，主要有以下幾種類型：①由細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)等生物衍生蛋白所制成的生物衍生支架，如膠原、層粘連蛋白、糖胺聚糖等；②具有組織黏附性和某些生理活性的功能性生物模擬支架，是采用工程學(xué)方法再現(xiàn)生物環(huán)境的支架；③人體或動物組織去除細胞成分只留下ECM的脫細胞生物支架。脫細胞生物支架是指從人或動物組織中除去具有免疫原性的細胞成分，以形成僅保留ECM的動物組織衍生的支架[1]。脫細胞組織是由天然ECM得到的，在植入體內(nèi)后，能夠隨時間的延長逐漸被患者自身的組織所取代，狀態(tài)良好時還會隨患者患處組織的生長而生長。在調(diào)節(jié)生物物理刺激，生物化學(xué)和分子信號以及空間結(jié)構(gòu)方面天然ECM發(fā)揮重要作用。細胞和ECM之間的相互作用被認(rèn)為是動態(tài)互益的過程，決定細胞生長情況并觸發(fā)細胞從增殖到組織結(jié)構(gòu)形成的轉(zhuǎn)變[2]。脫細胞生物支架在多種組織、器官中都有應(yīng)用。脫細胞的方法主要分為物理法、化學(xué)法和酶法，不同的脫細胞方法脫細胞效果不同，對ECM的影響也不同。通過脫細胞處理后所獲得的脫細胞生物支架已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于組織器官重建?，F(xiàn)對脫細胞生物支架的研究進展進行綜述。

1 脫細胞生物支架的研究和應(yīng)用

目前已有來自各種組織的脫細胞生物支架得以研究和應(yīng)用。Song和Ott[2]提出：脫細胞生物支架可作為組織工程學(xué)的構(gòu)建基礎(chǔ)，相比合成材料有更大的優(yōu)勢。脫細胞生物支架維持了天然的生物學(xué)結(jié)構(gòu)，并且使部分生物學(xué)功能得以保留，已成為最具潛力及可行性的產(chǎn)品與成果轉(zhuǎn)化熱點[3-4]。脫細胞生物支架在心臟瓣膜、真皮、血管、肝臟等組織器官中均已應(yīng)用，見表1。

2 脫細胞方法

2.1去細胞化的基本原理 去細胞化的目的是有效去除所有細胞成分，同時盡量減少任何不利影響，保留有生物活性和機械完整性的ECM。無效的去細胞化與炎癥反應(yīng)有關(guān)，可減緩或完全抑制建設(shè)性重塑結(jié)局[27]。無論哪種脫細胞方法都能破壞ECM的結(jié)構(gòu)和組成。組織去細胞化的目的是徹底去除細胞和細胞殘余物，同時盡可能保留天然ECM的三維超微結(jié)構(gòu)和組成。由于組織特異性因素如細胞密度、基質(zhì)密度和包括組織厚度和形狀在內(nèi)的幾何因素，組織和器官中脫細胞化的最佳方法各不相同。因細胞殘留物無法完全去除，脫細胞過程可能會對基質(zhì)造成一些破壞[28]。

從組織中去除細胞的效果取決于組織的來源和所使用的脫細胞方法。每種方法都會影響剩余ECM的生物化學(xué)組成、組織超微結(jié)構(gòu)和機械性能，進而影響機體對材料的反應(yīng)。

表1 脫細胞生物支架的應(yīng)用

常用的脫細胞方法有物理法(凍融、加壓、超聲等)、化學(xué)法(酸、堿、低滲及高滲溶液、非離子型除垢劑、離子型除垢劑、兩性離子型除垢劑、金屬離子螯合劑等)、酶法(核酸酶、胰蛋白酶、脂肪酶等)以及上述方法的聯(lián)合使用[29]。

2.2物理法

2.2.1凍融循環(huán) 細胞在經(jīng)過反復(fù)多次凍融循環(huán)后可被裂解，在不影響ECM超微結(jié)構(gòu)的同時也不會減少ECM中的蛋白成分[30]，使用該方法時可加入冷凍保護劑，如5%的海藻糖。鄭幸龍等[11]在制備脫細胞支架時，將組織在-80 ℃環(huán)境下冷凍24 h后解凍，反復(fù)凍融2～3次，然后再結(jié)合化學(xué)法灌注來完成脫細胞。彭章松等[31]為了制備高質(zhì)量的脂肪脫細胞基質(zhì)，將脂肪置于液氮冷凍，后經(jīng)37 ℃水浴加熱融化，反復(fù)5次；離心后去除上層油脂，后將下層脂肪置于勻漿機，經(jīng)20 000 r/min勻漿處理1 min，然后再用胰酶消化液處理。可見，凍融循環(huán)常作為輔助方法用以脫細胞。

2.2.2壓力法 超高壓方法可以有效去除血管等組織中的細胞，并具有滅菌效果[31]。在脫細胞過程中可以在組織上施加一系列梯度壓力，以提高將細胞裂解劑遞送到組織中的速度和效率，并使細胞碎片從組織脫離。Yoshihide等[32]在對豬角膜進行脫細胞處理時利用了高靜壓技術(shù)，在有效去除細胞同時也保持了膠原纖維的排列結(jié)構(gòu)。在低溫環(huán)境中，高壓能夠保持膠原纖維聚集排列，并減少糖胺聚糖的損失。此外，使用該技術(shù)可不另添加除垢劑，無細胞毒性。然而該技術(shù)所需的設(shè)備昂貴，制備成本高，限制了其應(yīng)用和發(fā)展[33]。

2.2.3機械振蕩法 該法為常用脫細胞方法，即將組織浸入化學(xué)除垢劑或酶溶液中，然后通過振蕩產(chǎn)生的能量破壞細胞，將細胞從基膜分離除去，但直接的機械力量也可能會造成ECM超微結(jié)構(gòu)的損壞[34]。使用機械振蕩也可視為化學(xué)法的輔助手段，用來加快脫細胞的速度和達到更好的脫細胞效果。以角膜為例，將其置于除垢劑或酶溶液中，施加機械振蕩，使除垢劑或酶與角膜基質(zhì)充分接觸，機械振蕩本身也具有脫細胞作用，因此可以獲得更好的脫細胞效果[35]。

2.2.4超臨界流體法 超臨界流體的低黏度和高通量特性可作為簡單的脫細胞方案。使用惰性物質(zhì)(如二氧化碳)去除細胞的超臨界脫細胞化能最小限度改變ECM機械性能。此外，脫細胞后可以在干燥條件下獲得組織，因此不需要凍干。二氧化碳在適中條件下(溫度32 ℃，壓力7.4 MPa)形成臨界流體，并且已經(jīng)顯示在置于乙醇溶液中僅15 min就能從主動脈組織中有效除去細胞[36]。超臨界流體在其他組織去細胞化中的廣泛適用性仍有待確定。

僅使用物理法脫細胞效果有限，一般作為輔助方法與化學(xué)法或酶法聯(lián)合使用[37]。

2.3化學(xué)法

2.3.1堿性和酸性方法 在脫細胞方法中使用堿處理和酸處理以溶解細胞質(zhì)成分以及去除核酸。常用試劑有乙酸、過乙酸、鹽酸、硫酸、氫氧化銨，可以有效破壞細胞膜和胞內(nèi)細胞器。姜濤等[23]在無菌條件下剪除皮下脂肪組織，1 mol/L NaCl溶液37 ℃ 24 h，去表皮，2%NaOH 45 ℃搖床處理4 h，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗至溶液呈中性。冷凍干燥，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2非離子型除垢劑 非離子型除垢劑因?qū)M織結(jié)構(gòu)的影響相對溫和，已廣泛用于各種組織器官的脫細胞。非離子型除垢劑會破壞脂質(zhì)-脂質(zhì)和脂質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，留下蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，使組織或器官中的蛋白質(zhì)在經(jīng)過非離子型除垢劑處理后仍留有功能性的構(gòu)象。Triton X-100是研究最廣泛的用于脫細胞的非離子型除垢劑。Triton X-100 對ECM的蛋白成分、糖胺聚糖和生長因子等的損害較十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)小[38]。邢輝等[39]先采用Triton X-100和脫氧膽酸鈉處理的方法制備出了脫細胞脊髓支架，其后又采用碳二亞胺交聯(lián)結(jié)合化學(xué)萃取法(液氮結(jié)合42 ℃恒溫水浴反復(fù)凍融6次+1% Triton X-100+1%脫氧膽酸鈉+碳二亞胺交聯(lián)+液氮結(jié)合42 ℃恒溫水浴反復(fù)凍融6次+1% Triton X-100+1%脫氧膽酸鈉)制備脫細胞脊髓支架。

2.3.3離子型除垢劑 離子型除垢劑對細胞質(zhì)和細胞核膜兩者均有效，脫細胞效果比非離子型除垢劑更好，但會破壞ECM中的蛋白結(jié)構(gòu)，并且會損失部分基質(zhì)成分。常用的離子型除垢劑包括SDS、脫氧膽酸鈉和Triton X-200。采用SDS從組織去除細胞成分非常有效。Uygun等[40]首次通過門靜脈插管向肝灌注梯度濃度的SDS制備出了大鼠脫細胞的肝支架。姜楠等[41]在制備大鼠肝臟脫細胞支架時，先后使用0.01 mol/L PBS、0.01% SDS、0.1% SDS、1% SDS以及1%Triton X-100進行灌注。其中Triton X-100作為輔助試劑。

2.3.4兩性離子型除垢劑 兩性離子型除垢劑的親水基團上的凈零電荷在去細胞化過程中保護蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)。兩性離子型除垢劑包括3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨]-1-丙烷磺酸鹽，磺基甜菜堿。與非離子型除垢劑相比，磺基甜菜堿顯示出更好的ECM保存效果和細胞去除效果[42]，相比SDS離子型除垢劑，3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨]-1-丙烷磺酸鹽保留更多的膠原蛋白、糖胺聚糖和彈性蛋白，同時仍能去除95%的細胞材料[43]。

2.3.5低滲和高滲溶液 用低滲或高滲溶液進行滲透性休克，如去離子水或低離子強度溶液可使細胞膨脹裂解[44]。低滲溶液通過滲透效應(yīng)破壞細胞膜，聯(lián)合除垢劑使用更有利于溶解細胞。高滲溶液能增加DNA的溶解度，在脫細胞后期能夠清除洗脫支架中殘留的核酸成分[45]。如在低滲溶液中10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，5 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)處理11 h，然后在高滲溶液50 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，1 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA中處理11 h可引起細胞裂解，但僅使用這種方法仍會殘留部分細胞成分[46]。通常需要結(jié)合酶或化學(xué)方法來去除細胞碎片。

2.3.6螯合劑 EDTA和EGTA等螯合劑能夠與中心金屬離子牢固地結(jié)合在一起形成一個環(huán)狀分子復(fù)合物。Ca2+和Mg2+是細胞附著于膠原蛋白和纖連蛋白的Arg-Gly-Asp受體所必需的二價陽離子。螯合劑通過結(jié)合二價陽離子使細胞難以附著于ECM上，從而達到去除細胞的目的。EDTA通常與胰蛋白酶組合使用。趙小軍等[47]用疊氮鈉溶液處理后刮去兔膀胱黏膜層，清洗后將置于EDTA和胰蛋白酶混合溶液中浸泡，并用甲醛、戊二醛交聯(lián)保護，再經(jīng)過漂洗后分別用0.9%NaCl注射液、脫氧核糖核酸酶、脫氧膽酸鈉浸泡，成功制備兔膀胱脫細胞支架。

2.4酶法 去細胞化所用的酶包括胰蛋白酶、核酸酶、半乳糖苷酶、嗜熱菌蛋白酶等。酶類可以特異性去除細胞殘余物及部分ECM組分。但單用酶類去細胞效果不足，并且支架中可能殘存的酶會激發(fā)免疫反應(yīng)，也會影響組織細胞化[30]。核酸酶(脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶)能破壞核酸序列，有助于去除核酸成分；但核酸酶也會對ECM成分及表面結(jié)構(gòu)造成損害[48]。胰蛋白酶是脫細胞方案中最常使用的酶，錢闖等[49]將肌腱纖維束在無菌操作下置入絲氨酸蛋白酶抑制劑中，在室溫條件下處理24 h。無菌PBS沖洗后，移入低濃度胰蛋白酶和乙醇混合溶液中，在不破壞ECM的情況下去除細胞壁，室溫下處理5 h后，再將纖維束移入脫氧核糖核酸酶溶液中處理5 h。最后將支架用PBS沖洗48 h，置于無菌室內(nèi)在室溫條件下干燥。成功制備牛肌腱脫細胞支架。

3 脫細胞效果驗證方法及對支架的評價

3.1驗證細胞去除 經(jīng)蘇木精-伊紅染色觀察可見脫細胞基質(zhì)為紅色，未觀察到細胞核，且觀察不到細胞殘余現(xiàn)象，表明獲得理想的脫細胞支架材料。對制備好的脫細胞支架用掃描電鏡觀察，可見包含大量呈交錯排列的白色膠原纖維，表面未出現(xiàn)細胞碎裂殘片，進一步驗證了脫細胞的效果[47]。路英進等[50]還使用了細胞核熒光染色的方法來觀察。苑志國等[10]使用DNA定量分析來判斷脫細胞后的DNA殘留，結(jié)果顯示脫細胞后DNA殘留小于 100 pg/mg。

3.2去除殘留的化學(xué)物質(zhì) 一般采用PBS清洗數(shù)小時，以去除脫細胞過程中所使用的化學(xué)物質(zhì)，并洗去殘余的細胞碎片[51-52]。劉賓等[53]采用超聲空化法，將脫細胞血管支架修剪為5 mm×25 mm的片狀，置于0 ℃的PBS溶液中，用經(jīng)過滅菌處理的超聲探頭垂直浸入PBS液中約2 cm，超聲處理 60 s，累計強度為300 W，在進一步去除脫細胞支架中殘余化學(xué)物質(zhì)的同時，疏松化程度明顯提高，仍保持良好的生物學(xué)相容性，且種子細胞在支架內(nèi)的生長情況明顯好于未經(jīng)超聲處理的支架。

3.3干細胞與脫細胞支架的生物相容性 通過測定干細胞在脫細胞支架浸提液與在杜氏改良Eagle培養(yǎng)基中增殖率和生長曲線，可以判斷干細胞與相應(yīng)脫細胞支架的生物相容性。趙陽等[54]用此法得到：在第1、3、5天，在脫細胞支架浸提液中干細胞增殖是杜氏改良Eagle培養(yǎng)基的98.8%、104.2%、111.1%，平均相對增殖率為104.7%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，兩組的生長曲線也無明顯差異，生物相容性較好。蔣丹等[55]也通過對比細胞形態(tài)表征，即細胞在支架上增殖后再通過掃描電子顯微鏡和熒光顯微鏡觀察來判斷脫細胞支架的生物相容性。

4 小 結(jié)

目前，已經(jīng)有較多生物支架材料產(chǎn)品成功用于臨床，其中不乏脫細胞生物支架產(chǎn)品，并且脫細胞支架更是研究熱點。對組織進行去細胞化時，有多種脫細胞方法可以選擇，或?qū)⒍喾N方法結(jié)合使用以達到更理想的脫細胞效果。在構(gòu)建生物支架時，將脫細胞支架與其他材料結(jié)合構(gòu)建復(fù)合支架以達到預(yù)期目的也是一種選擇。脫細胞方法的選用需要考慮多種因素：組織的來源、細胞數(shù)量、致密程度以及脂質(zhì)的含量、厚度等。不同的脫細胞方法及所使用的脫細胞試劑都會對ECM產(chǎn)生不同程度改變或破壞，盡量減少對ECM造成不必要的破壞是脫細胞的目標(biāo)。