慢性腎臟病礦物質(zhì)和骨異常患者血清白細(xì)胞介素-18、分泌型Klotho和骨保護(hù)素的表達(dá)及意義

富 麗,劉勝陽(yáng),張寶桐,任麗麗,郭冬慈,吳 丹,張繹平 ,靳蕊霞

1.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院(錦州121000);2.遼寧省遼陽(yáng)市中心醫(yī)院血液透析室(遼陽(yáng) 111000)； 3.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科(錦州121000)

慢性腎臟病礦物質(zhì)和骨異常(Chronic kidney disease-mineral and bone disorder,CKD-MBD)是慢性腎臟病(Chronic kidney disease, CKD)常見(jiàn)并發(fā)癥之一，包括血清標(biāo)志物的改變、骨組織的改變及軟組織鈣化等，當(dāng)腎小球?yàn)V過(guò)率(Glomerular filtration rate, GFR)下降時(shí)，高磷血癥的發(fā)生率增加，此時(shí)可以觀察到血清中相關(guān)指標(biāo)的變化，包括微炎癥性改變及相關(guān)的細(xì)胞因子的改變[1]。白細(xì)胞介素-18(Interleukin-18, IL-18)是促炎細(xì)胞相關(guān)因子，其可以激發(fā)機(jī)體中白細(xì)胞介素家族中的其它成員的活性，誘發(fā)炎性及免疫性的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[2]?？顾ダ系鞍譑lotho在血清中以分泌型Klotho(Secretory Klotho ,sKlotho)存在，是近年關(guān)注重要的細(xì)胞因子，其表達(dá)升高時(shí)可以抑制炎癥反應(yīng)，對(duì)腎組織等臟器可能具有保護(hù)作用[3]。骨保護(hù)素(Osteoprotegerin,OPG)作為腫瘤壞死因子受體家族的重要成員，主要由上皮細(xì)胞和間葉細(xì)胞分泌，在血管鈣化時(shí)發(fā)揮自分泌和旁分泌的作用，誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)水腫[4]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-18、sKlotho和OPG在CKD-MBD患者血清中的含量，分析其臨床意義。

資料與方法

1 一般資料 選擇2017年1月至2019年1月在我院診斷和治療的CKD-MBD患者共55例作為觀察組，男29例，女26例，年齡35～75歲，中位年齡48.9歲。選擇CKD的患者50例為對(duì)照組，男25例，女25例，年齡34～67歲，中位年齡47.6歲。選擇無(wú)明顯器質(zhì)性疾病的成年人50例作為正常對(duì)照組，男25例，女25例，年齡22～60歲，中位年齡45.9歲。三組在基線資料比較中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬均簽署知情同意書。CKD納入標(biāo)準(zhǔn)：腎損害≥3月，伴或不伴GFR下降。CKD-MBD診斷標(biāo)準(zhǔn)：①血清鈣、磷、全段甲狀旁腺激素(Intact parathyroid hormone，iPTH)或維生素D代謝異常；②骨轉(zhuǎn)化、礦化、骨量或骨強(qiáng)度異常；③血管或其他軟組織鈣化。上述伴隨癥中有一點(diǎn)即可診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①骨折等原發(fā)性骨疾??；②佝僂病史；③惡性腫瘤；④大劑量糖皮質(zhì)激素；⑤肝、膽疾??；⑥腎移植患者；⑦甲狀旁腺手術(shù)史患者。

2 研究方法 觀察組在確診后、對(duì)照組于清晨均常規(guī)性抽取空腹靜脈血3 ml，室溫靜置30 min后，3000 r/min,離心15min，分離血清，保存于-20℃冰箱中備用。IL-18、sKlotho和OPG試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)公司，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)三種因子的表達(dá)。嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。簡(jiǎn)要步驟：向反應(yīng)板各孔加入100 μl樣品,37℃孵育2 h；洗滌、吸干，加入100 μl一抗，混勻,37℃孵育1 h；洗滌、吸干后，加入100 μl酶標(biāo)抗體稀釋液后，在37℃環(huán)境中孵育30 min；板洗滌、吸干后，加入100 μl終止液，混勻；于20 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度。全程做好質(zhì)控工作。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料兩組間的比較行t檢驗(yàn)，計(jì)量資料多組間的比較行方差分析，組間計(jì)數(shù)資料率的比較行卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 三組中IL-18、sKlotho和OPG表達(dá)比較 見(jiàn)表1。三組中IL-18、sKlotho和OPG的表達(dá)應(yīng)用SNK法進(jìn)行兩兩比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即觀察組中高表達(dá)。

表1 三組血清中IL-18、sKlotho和OPG表達(dá)的比較

2 觀察組不同GFR和基礎(chǔ)疾病分組中IL-18、sKlotho和OPG表達(dá)比較 見(jiàn)表2。觀察組中IL-18、sKlotho和OPG在不同GFR水平的表達(dá)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三者在不同基礎(chǔ)疾病情況的表達(dá)中差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 觀察組不同GFR和基礎(chǔ)疾病分組中IL-18、sKlotho和OPG表達(dá)比較(ng/L)

3 觀察組中IL-18、sKlotho和OPG的表達(dá)與血清中iPTH、ALP表達(dá)的相關(guān)性 應(yīng)用相關(guān)分析顯示觀察組中IL-18與iPTH(r=0.46，P=0.042)、IL-18與堿性磷酸酶(ALP)(r=0.42，P=0.045)存在正相關(guān)性，sKlotho、OPG與iPTH、ALP之間均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

4 觀察組中IL-18、sKlotho和OPG表達(dá)的相關(guān)性分析 應(yīng)用相關(guān)分析顯示觀察組中IL-18和sKlotho、IL-18和OPG、sKlotho和OPG之間的表達(dá)均無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。

討 論

CKD-MBD是指由慢性腎疾病引起的繼發(fā)性病變。近年研究認(rèn)為其病變發(fā)展時(shí)機(jī)體可以出現(xiàn)微炎癥的狀態(tài)。IL-18是炎癥相關(guān)因子，由中性粒細(xì)胞的趨化，肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間葉細(xì)胞入其它活性因子均可以分泌IL-18，對(duì)機(jī)體的免疫有一定作用[5]。IL-18能在微炎環(huán)境中誘導(dǎo)細(xì)胞變形，分泌少量的超氧化物和溶酶體酶，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。IL-18能對(duì)NK細(xì)胞有一定的調(diào)節(jié)作用，能促進(jìn)CD4+和CD8+陽(yáng)性的淋巴細(xì)胞的增殖，使輔助T細(xì)胞分化。在IL-18起作用的過(guò)程中，機(jī)體中多種因子可以有協(xié)同作用[6]，sKlotho蛋白即為與IL-18有關(guān)的細(xì)胞因子，不僅與炎癥反應(yīng)有關(guān)，還參與哺乳動(dòng)物的抗衰老過(guò)程，近年研究顯示sKlotho也與代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其合成不足時(shí)可引起各種機(jī)體退性相關(guān)的癥狀和疾病[7]。Klotho主要有兩種形式，即膜結(jié)合型和分泌型。膜結(jié)合型Klotho主要在腎臟、前列腺和胎盤的上皮成分中表達(dá)；分泌型Klotho是膜結(jié)合型Klotho在激酶誘導(dǎo)下產(chǎn)生的，不含跨膜區(qū)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，表達(dá)為游離的狀態(tài)，在血液和尿液中大量存在，其高表達(dá)時(shí)被認(rèn)為與機(jī)體的保護(hù)作用有關(guān)[8]。多種炎性因子可以上調(diào)OPG的含量。研究認(rèn)為OPG的表達(dá)升高能加重腎上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的水腫，加速腫瘤細(xì)胞的分解，研究顯示有效的抑制OPG的表達(dá)，能減少血管壁的通透性，減少炎細(xì)胞的游出，降低炎癥的微環(huán)境[9]。OPG能激活I(lǐng)L-6和IL-23等炎癥相關(guān)介質(zhì)，引起腎及骨組織的損傷。

研究結(jié)果顯示CKD-MBD中IL-18、sKlotho和OPG的表達(dá)明顯高于CKD和正常對(duì)照組，提示三種因子在CKD-MBD的病變發(fā)展中起作用。結(jié)果顯示IL-18、sKlotho和OPG在不同GFR水平的表達(dá)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示三者參與病變的進(jìn)展。結(jié)果顯示IL-18與iPTH、IL-18與堿性磷酸酶(Alkaline phosphates,ALP)的表達(dá)具有正相關(guān)性，提示其具有正向協(xié)同作用。ALP 是一組同工酶，來(lái)源于肝、腎臟和白細(xì)胞等，ALP在結(jié)構(gòu)和功能正常時(shí)均提示骨組織是正常的，其為正常骨細(xì)胞的標(biāo)志物。因此ALP表達(dá)變化在慢性腎臟病中的標(biāo)記作用可能更有意義，主要與血清中ALP的表達(dá)常不受GFR的影響有關(guān)。ALP可能是鈣化性病理變化的始動(dòng)因素。ALP的失活能減少膠原纖維的鈣化。實(shí)驗(yàn)中顯示出IL-18與ALP具有明顯正相關(guān)性，提示IL-18正常表達(dá)可能也在一定程度上反應(yīng)ALP的血清含量，IL-18也是重要的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。CKD 患者常規(guī)檢查iPTH用于監(jiān)測(cè)骨細(xì)胞的異常轉(zhuǎn)化情況。PTH在骨轉(zhuǎn)化時(shí)可影響成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及其他骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和相關(guān)功能[10]。但是PTH 的生物變異度高，其與營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和炎癥反應(yīng)等有關(guān)[11]。本研究中顯示IL-18與iPTH有一定的相關(guān)性，提示IL-18對(duì)病變的形成有重要作用。也有研究認(rèn)為IL-18可能具有多向作用，由于PTH并不是一個(gè)低轉(zhuǎn)運(yùn)CKD-MBD的診斷指標(biāo)，因此IL-18可能在一定程度上反應(yīng)骨轉(zhuǎn)化情況[12]。IL-18、sKlotho和OPG的調(diào)節(jié)通路可能不同，而sKlotho和OPG不具有早期炎癥反應(yīng)因子的作用，其主要參與中、晚期炎癥反應(yīng)的形成及繼發(fā)性的骨組織轉(zhuǎn)變[13]。但是IL-18、sKlotho和OPG的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚需要更多的研究來(lái)進(jìn)行闡明。實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)IL-18、sKlotho和OPG之間具有相關(guān)性，提示三者間不具有協(xié)同作用。

總之，IL-18、sKlotho和OPG高表達(dá)在CKD-MBD中有重要作用，三者的表達(dá)水平與病變的進(jìn)展有關(guān)。IL-18與iPTH和ALP存在正相關(guān)性。聯(lián)合檢測(cè)血清中IL-18、sKlotho和OPG的表達(dá)可能成為CKD-MBD的早期診斷標(biāo)志物，其機(jī)制與CKD-MBD是炎性病變的機(jī)制有關(guān)。