人晶狀體上皮細(xì)胞BHMT基因過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定*

周海燕,薛雨順,王新川,高寧寧

1.陜西省人民醫(yī)院眼科(西安 710068);2.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(西安 710032)

大量的研究已證實(shí)蛋氨酸(Methionine,Met) 對(duì)維持晶狀體透明度是非常重要的，它是抗氧化物谷胱甘肽的前體[1-2]。甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Betaine-homocysteinemethy transferase，BHMT)是Met循環(huán)中重要的酶，它利用同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)和提供甲基的甜菜堿(Betaine，Bet)催化 Met 的再合成[3-4]。在胎兒晶狀體文庫中，BHMT 是一個(gè)大量表達(dá)的基因[5]。前期我們利用基于同位素相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究分析了不同年齡人白內(nèi)障晶狀體核與透明晶狀體核間的差異蛋白質(zhì),首次報(bào)道了BHMT在高齡組白內(nèi)障晶狀體核區(qū)的水平較年輕組明顯下調(diào)，進(jìn)一步通過新的臨床白內(nèi)障晶狀體標(biāo)本進(jìn)行了驗(yàn)證[6]。但其在晶狀體老化和白內(nèi)障形成中如何參與代謝等確切機(jī)制尚不清楚。本研究將構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)BHMT的慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細(xì)胞，為進(jìn)一步研究其在白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展中的作用提供生物學(xué)基礎(chǔ)。

材料與方法

1 主要試劑及儀器 人晶狀體上皮細(xì)胞(Human lens epithelial cells,HLEC)由本實(shí)驗(yàn)室保存,慢病毒GV358載體、AgeI / AgeI 酶切，購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。1kp DNA ladder Marker(Fermentas公司),瓊脂糖(賽百盛公司),250 bp DNA ladder Marker與Primer(捷瑞生物公司)。In-FusionTMPCR Cloning Kit (Clontech公司),瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化,Taq polymerase(SinoBio公司),限制性內(nèi)切酶(NEB公司)。dNTP(Takara公司), PCR儀(Applied Biosystems), DMEM培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清)購自 Gibco 公司，引物由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。

2 細(xì)胞培養(yǎng) HLEC培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)15% 胎牛血清的低糖 DMEM 7培養(yǎng)液中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

3 研究方法

3.1 引物設(shè)計(jì)和合成：從Gen Bank 資料庫中獲得人 BHMT 的 mRNA 序列(NM-001713),基因引物設(shè)計(jì)為：上游 5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGCCACCCGTTGGGGGCAAAAAG- 3′；下游：5′- TCCTTGTAGTCCATACCCTGTGATTTGAATTTTTGTTTTTC - 3′。聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增 BHMT 基因片段。

3.2 BHMT-GV358 過表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建：用 Age I 酶對(duì)純化的 GV358 質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行酶切，對(duì)載體酶切產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶，獲得線性化的 GV358 載體。將RT-PCR擴(kuò)增純化的BHMT基因片段與酶切后 GV358 質(zhì)粒 DNA連接得到重組載體GHMT-GV358，行 PCR 鑒定，鑒定的陽性克隆轉(zhuǎn)化子測(cè)序,測(cè)序結(jié)果和目的基因序列比對(duì)分析。將正確的菌液轉(zhuǎn)接到10 ml 含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，進(jìn)行質(zhì)粒抽提。

3.3 慢病毒包裝及滴度測(cè)定：將該慢病毒包裝系統(tǒng)中的3種質(zhì)粒(BHMT-GV358 20 μg，pHelper 1.0載體 15 μg，pHelper 2.0 載體 10 μg)與轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫下孵育15 min，將復(fù)合物加入293T細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育養(yǎng)，于37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)6～8 h, 棄去原培養(yǎng)基，換上10 %含 FBS 的 DMEM 10 ml，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集含有病毒顆粒的細(xì)胞上清。將取得的病毒上清液于25 000 r/min，4 ℃條件下離心2 h，收集沉淀，加入適量病毒保存液，重懸，高速離心5 min 后，取上清，分裝并保存至-80 ℃冰箱。進(jìn)行慢病毒滴度測(cè)定。

3.4 BHMT基因表達(dá)檢測(cè)：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞接種到24孔板中(細(xì)胞數(shù)約為 2×104)，37℃、5% CO2環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞融合度達(dá)到約80%。使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染，4～6 h 后觀察細(xì)胞狀態(tài)，更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h 后觀察質(zhì)粒熒光標(biāo)記基因表達(dá)情況，判斷轉(zhuǎn)染效率，熒光率大于80%，熒光拍完后補(bǔ)加500 μl正常培養(yǎng)基，待長(zhǎng)滿后收集細(xì)胞用于RNA提取或蛋白質(zhì)檢測(cè)。①RT- PCR檢測(cè)BHMT mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組：陰性對(duì)照組(NC組)、BHMT過表達(dá)組(OE組)用于擴(kuò)增基因的引物序列上游：5'- CCACTTTGACCCCACCATTA- 3'，下游：5'- GCTAGCTCATTTGTCGTCATC- 3'；以 GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參照基因，用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。mRNA 相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt，ΔCt=目的基因 Ct 值-內(nèi)參基因 Ct 值，-ΔΔCt=對(duì)照組 ΔCt 平均值-各樣品ΔCt 值。②Western blot 法檢測(cè)BHMT基因表達(dá)。各組細(xì)胞裂解后超聲破碎細(xì)胞，取上清 BCA 法測(cè)定蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品，經(jīng) SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% 脫脂牛奶室溫封閉 2 h之后于 4 ℃ 冰箱內(nèi)與一抗孵育過夜，室溫漂洗后給予二抗孵育1 h，再次漂洗后加入配置好的顯色液，用ECL法結(jié)合X光片顯色。

3.5 慢病毒感染人晶狀體上皮細(xì)胞:人晶狀體上皮細(xì)胞分為兩組，感染組,(LV-BHMT24172-1)病毒感染，對(duì)照組,陰性對(duì)照病毒CON220感染，分別接種于 6 孔板，細(xì)胞密度為20%，感染條件為Eni.S+polybrene，以感染復(fù)數(shù)(MOI)= 10 計(jì)算病毒量，感染后 16 h更換感染液,72 h于熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況，熒光率要達(dá)到70%～80%左右，細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右后進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

結(jié) 果

1 成功構(gòu)建BHMT-GV358 載體 PCR 擴(kuò)增目的基因并行凝膠電泳，見目的條帶出現(xiàn)于1262 bp 處(圖 1)。構(gòu)建 BHMT-GV358 重組載體后，進(jìn)行 PCR 鑒定，顯示在第5～12泳道出現(xiàn)目的條帶(圖 2)，陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小為655 kb，進(jìn)行測(cè)序及比對(duì)驗(yàn)證，經(jīng) GenBank 中BHMT序列對(duì)比驗(yàn)證，序列完全一致，表明已成功構(gòu)建重組質(zhì)粒(圖 3)。

2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光觀察及滴度測(cè)定 將BHMT-GV358 病毒包裝后感染 293T細(xì)胞，熒光顯微鏡見熒光表達(dá)結(jié)果較強(qiáng)(圖4)。細(xì)胞內(nèi)觀察到明顯熒光，說明目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常，熒光標(biāo)記基因表達(dá)正常，表示 BHMT蛋白可以在 293T細(xì)胞中表達(dá)。根據(jù)計(jì)算公式qPCR 滴度(TU/ml)=N×C/V，計(jì)算平均滴度。經(jīng)滴度檢測(cè)，病毒滴度約為2.00E+08TU/ml。

3 RT-PCR 檢測(cè) BHMT基因表達(dá)情況 見表1。將病毒濃縮液加入293T細(xì)胞培養(yǎng)基，獲得穩(wěn)定感染的293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后提取細(xì)胞內(nèi)總 RNA，利用RT-PCR 法檢測(cè)BHMT mRNA 的表達(dá)水平，所得結(jié)果與GAPDH的結(jié)果相比較。在本實(shí)驗(yàn)中過表達(dá)組BHMT基因表達(dá)豐度明顯升高，是對(duì)照組的986.181倍(圖5)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 BHMT基因在各組的表達(dá)豐度

注：與過表達(dá)組與對(duì)照組相比, *P<0.05

圖1 BHMT基因片段的PCR擴(kuò)增

1:陰性對(duì)照(ddH2O); 2:陰性對(duì)照(空載體);3:陽性對(duì)照(GAPDH);4:Marker：5、3、2 、1.5、1 kb，750、500、250、100 bp；5～12：轉(zhuǎn)化子

圖2 BHMT-GV358載體的酶切鑒定

圖3 克隆序列測(cè)序圖

圖4 BHMT-GV358載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(熒光視野與明視野對(duì)照?qǐng)D)(100×, 200×)

圖5 轉(zhuǎn)染后各組 BHMT mRNA 相對(duì)表達(dá)量 (P<0.05)

4 慢病毒感染人晶狀體上皮細(xì)胞 熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染后的過表達(dá)細(xì)胞系可見GFP表達(dá)，感染效率在90%左右(圖6)

圖6 慢病毒感染人晶狀體上皮細(xì)胞

5 Western blot 方法檢測(cè) BHMT蛋白表達(dá)情況 感染重組慢病毒BHMT 48 h 后收集重組慢病毒感染和對(duì)照未感染的293T細(xì)胞，檢測(cè)BHMT蛋白表達(dá),Western blot檢測(cè)可以觀察到47 kD附近處有特征條帶，大小與目的基因融合蛋白吻合。提示此質(zhì)粒用FLAG抗體檢測(cè)到BHMT，可在 293T細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)，且在感染組中明顯高于對(duì)照組(圖 7)。

圖7 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染組(OE)與對(duì)照組(NC)BHMT蛋白表達(dá)

討 論

前期我們利用基于同位素相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究分析了不同年齡人白內(nèi)障晶狀體核與透明晶狀體核間的差異蛋白質(zhì), 并首次報(bào)道了BHMT在高齡組白內(nèi)障晶狀體核區(qū)的水平較年輕組明顯下調(diào)，進(jìn)一步通過新的臨床白內(nèi)障晶狀體標(biāo)本進(jìn)行了驗(yàn)證[6]。但其在晶狀體老化和白內(nèi)障形成中如何參與代謝等確切機(jī)制尚不清楚。Rao 等[7]第一次在恒河猴的晶狀體核中發(fā)現(xiàn)了BHMT，其表達(dá)約占核部總蛋白的 0.5%～10%，但具體機(jī)制不清。人源 BHMT的研究表明，BHMT 是含 Zn2+的金屬酶，相對(duì)分子量為 45×103,由 406 個(gè)氨基酸組成[8]。Met 或谷胱甘肽與白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān)[9-10]。BHMT 是 Met 循環(huán)中重要的酶, 是Hcy代謝過程中重要的酶類，在對(duì)高Hcy血癥的研究中發(fā)現(xiàn)，BHMT 表達(dá)與生物學(xué)活性降低是高 Hcy 血癥發(fā)生的分子基礎(chǔ), 它可以調(diào)控 Hcy 的水平。BHMT 是 Hcy 重新甲基化生成 Met 的關(guān)鍵酶，是機(jī)體在生理狀況下維持 Hcy穩(wěn)定代謝水平的重要功能蛋白質(zhì)。高 Hcy 除了與心血管疾病、神經(jīng)性疾病、糖尿病等全身疾病相關(guān)外[11-12]，與白內(nèi)障等眼部疾病的發(fā)生發(fā)展密切[13-17]。研究發(fā)現(xiàn)在相同的誘導(dǎo)條件下BHMT 轉(zhuǎn)基因小鼠的高 Hcy 血癥發(fā)病率明顯低于對(duì)照組，并可保護(hù)肝臟細(xì)胞免受高Hcy濃度的損傷[18]。Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)兩種miRNAs 通過分化靶向海刺參中 BHMT 來直接影響體腔細(xì)胞中Hcy 含量，靶基因BHMT siRNA 或補(bǔ)充Hcy均可明顯促進(jìn)體腔細(xì)胞 ROS 的產(chǎn)生，表明靶基因BHMT通過調(diào)控Hcy的含量發(fā)揮生物學(xué)功能。更值得關(guān)注的是, BHMT 不僅對(duì)已生成的 Hcy 具有高效直接的轉(zhuǎn)化功能，且由于與細(xì)胞膜有很好的親和性，外源性 BHMT 能被吸收入細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)功能。因此，調(diào)控或直接補(bǔ)充 BHMT 已經(jīng)成為高Hcy 血癥治療研究的一個(gè)新的重要熱點(diǎn)。

慢病毒(Lentivirus)載體是基于人類免疫缺陷型病毒(HIV)發(fā)展起來的基因治療載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞都具有感染力，能在體內(nèi)較長(zhǎng)期表達(dá)且安全性高。慢病毒感染目的細(xì)胞后不會(huì)再感染其他細(xì)胞，也不會(huì)利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒[20]，目前已廣泛應(yīng)用在以基因?yàn)榘悬c(diǎn)的各種基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中。通過慢病毒載體系統(tǒng)，我們能有效地將目的基因整合入宿主細(xì)胞基因組中，從而得到可以穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株，是研究基因及其表達(dá)產(chǎn)物功能的有力工具。我們首次在人老年性白內(nèi)障晶狀體核中篩選鑒定出了BHMT 的表達(dá)降低，非常有必要明確其表達(dá)的變化與老化和白內(nèi)障形成的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建并包裝了重組 BHMT-GV358慢病毒載體，成功轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，采用RT-PCR 在mRNA 水平檢測(cè)到BHMT表達(dá)明顯增加，說明BHMT BHMT-GV358能夠有效介導(dǎo)BHMT的過表達(dá)，并用構(gòu)建成功的BHMT基因過表達(dá)的慢病毒載體在體外有效感染了人晶狀體上皮細(xì)胞，為進(jìn)一步研究BHMT在 白內(nèi)障及與Hcy有關(guān)的疾病發(fā)病機(jī)制中的作用打下了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。