馬鈴薯高世代選系瘡痂病抗性評(píng)價(jià)及SSR輔助篩選

宋志軍 白雅梅 張靜華 張 抒 李 輝 呂文河* 魏 琪*

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；3 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

馬鈴薯瘡痂病是由多種致病鏈霉菌（Streptomyces ssp.）引起的土傳性病害。致病菌侵染部位變形，形成形狀不規(guī)則、深淺不一的栓質(zhì)化病斑，嚴(yán)重影響商品品質(zhì)和加工品質(zhì)。在中國，馬鈴薯瘡痂病作為次生病害起初未受到重視（魏延安，2005），隨著馬鈴薯種植面積擴(kuò)大，耕地面積受限，致使連作嚴(yán)重，進(jìn)而導(dǎo)致馬鈴薯瘡痂病逐年加重（何虎翼 等，2017）。

目前，國內(nèi)外關(guān)于馬鈴薯瘡痂病的研究主要集中在病原菌的鑒定和防治上。全世界范圍內(nèi)，馬鈴薯瘡痂病致病菌大約有50 種（聶峰杰 等，2018），在中國主要有S. scabies、S. turgidiscabies和S. acidiscabies 3 種（張萌 等，2009）。在瘡痂病防治方面，有輪作（Waterer，2002）、土壤熏蒸和種植綠肥（Mishra & Srivastava，2004）及施用微生物菌肥（靳海波 等，2015）等方法，成本高且不能完全防治。篩選抗瘡痂病種質(zhì)資源，培育抗病新品種，可以有效解決馬鈴薯瘡痂病問題，且節(jié)約成本，實(shí)現(xiàn)綠色生產(chǎn)，保護(hù)環(huán)境。目前，高抗瘡痂病的馬鈴薯品種資源較少。Pasco 等（2005）利用人工接種的方式篩選得到Nicola、BF15、Sirtema和Charlotte 4 個(gè)高抗瘡痂病品種（系）。何虎翼等（2017）利用田間病圃和人工接種相結(jié)合的方式篩選得到D825 和D731 兩個(gè)高抗瘡痂病品系。

SSR 分子標(biāo)記技術(shù)是研究作物遺傳多樣性的一種常用方法，在馬鈴薯育種中有廣泛的應(yīng)用，比如構(gòu)建遺傳圖譜、分析馬鈴薯資源的遺傳多樣性等（單友蛟 等，2010；石景，2011）。本試驗(yàn)擬采用田間自然病圃和人工接種兩種方法對(duì)20 份馬鈴薯高世代選系進(jìn)行抗性鑒定，結(jié)合瘡痂病指數(shù)和相對(duì)抗病指數(shù)對(duì)馬鈴薯材料的瘡痂病抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)，利用SSR 分子標(biāo)記分析馬鈴薯品系間的親緣關(guān)系，以探究馬鈴薯瘡痂病抗性與親緣關(guān)系之間的聯(lián)系，為抗瘡痂病育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

自然病圃抗性鑒定試驗(yàn)于2017 年5～9 月在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)示范區(qū)馬鈴薯病害研究試驗(yàn)地進(jìn)行，該地塊由于馬鈴薯7 a 連作，瘡痂病發(fā)病率高。

1.2 試驗(yàn)材料

供試材料為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯研究所提供的20 份高世代選系。在常規(guī)育種選擇過程中，一般是早代對(duì)薯形、芽眼深淺、匍匐莖長短等性狀進(jìn)行選擇，而高世代則主要對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)性狀進(jìn)行選擇。除N08-21-1（中薯3 號(hào)×Norland）外，其他品系中至少一個(gè)親本是荷蘭品種或利用荷蘭種質(zhì)資源選育的品種或無性系（表1）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)地塊致病菌鑒定 2017 年9 月，采集試驗(yàn)地收獲的馬鈴薯瘡痂病的感病塊莖，品種為克新18 號(hào)、荷蘭15 號(hào)、尤金、興佳2 號(hào)、閔薯1 號(hào)、延薯4 號(hào)、麥肯1 號(hào)和克新13 號(hào)。每個(gè)品種采集1 個(gè)塊莖，共8 個(gè)。使用無菌毛刷采集每個(gè)塊莖表皮上的土壤，8 份土壤樣品混勻?yàn)? 份。

將塊莖洗凈，使用75%酒精進(jìn)行表面消毒，再用無菌水沖洗2 次，晾干。切取瘡痂病病斑下病健交界處薯肉置于少量無菌蒸餾水中，用鑷子碾碎，室溫孵育30 min。將上述液體稀釋1 000 倍后涂布于1%的水瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃條件下暗培養(yǎng)，7～10 d 后挑取全部具有放線菌特征的菌落于酵母麥芽精瓊脂培養(yǎng)基（YME）上畫線純化，連續(xù)純化2～3 次。

表1 供試馬鈴薯品系系譜信息

稱取土壤樣品1 g 加入適量無菌水，室溫孵育30 min，6 000 r · min-1離心10 min 后吸取上清液。后續(xù)步驟同上。

用稱量勺刮取菌株的菌絲置于無菌離心管中，采用北京莊盟G+細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株DNA。以txtAB 基因特異性引物檢測菌株致病性，采用常規(guī)PCR擴(kuò)增法對(duì)菌株進(jìn)行種類鑒定（邢瑩瑩，2015），引物信息見表2。

表2 病原菌鑒定引物信息

1.3.2 自然病圃抗性鑒定 試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，單行區(qū)，行長5 m，壟距0.8 m，株距0.2 m，即每個(gè)小區(qū)25 株，4 次重復(fù)，采用當(dāng)?shù)靥镩g管理方式管理試驗(yàn)區(qū)。根據(jù)邢瑩瑩（2015）的盆栽接種試驗(yàn)結(jié)果，采用尤金為感病對(duì)照，克新18 號(hào)為抗病對(duì)照。種植120 d 收獲，收獲時(shí)調(diào)查每個(gè)小區(qū)所有質(zhì)量大于50 g 的馬鈴薯塊莖瘡痂病發(fā)病情況，調(diào)查病斑面積和病斑深度等級(jí)。瘡痂病病斑面積等級(jí)劃分：0 級(jí)，病斑面積為0；1 級(jí)，病斑面 積≤5.0%；2 級(jí)，5.0%＜病斑面積≤12.5%；3級(jí)，12.5%＜病斑面積≤25.0%；4 級(jí)，25.0%＜ 病斑面積≤50.0%；5 級(jí)，病斑面積＞50.0%。瘡痂病病斑深度等級(jí)劃分：1 級(jí)，0 mm ≤病斑深 度≤1 mm；2 級(jí)，1 mm ＜病斑深度≤2 mm；3級(jí)，2 mm ＜病斑深度≤3 mm；4 級(jí)，病斑深度＞3 mm。計(jì)算每個(gè)品種（系）每次重復(fù)的瘡痂病指數(shù)（scab index，SI）（Singhai et al.，2011；邢瑩瑩，2015）。

參考王躍棟等（2011）的方法，計(jì)算相對(duì)抗 病 指 數(shù)（relative resistance index，RRI），將 供試品種（系）劃分為4 個(gè)類型。高抗（HR），0.80 ≤RRI ≤1.00；中抗（MR），0.60 ≤RRI ＜0.80；中 感（MS），0.40 ≤RRI ＜0.60； 高 感（HS），RRI ＜0.40。

病斑面積等級(jí)（A）=Σ（各病斑面積等級(jí)塊莖數(shù)×該級(jí)數(shù)代表值）/調(diào)查塊莖總數(shù)

病斑深度等級(jí)（D）=Σ（各病斑深度等級(jí)塊莖數(shù)×該級(jí)數(shù)代表值）/調(diào)查塊莖總數(shù)

瘡痂病指數(shù)（SI）=100×（A×D）/20

相對(duì)抗病指數(shù)（RRI）=1-所測品種（系）瘡痂病指數(shù)平均值/發(fā)病最重品種（系）瘡痂病指數(shù)平均值

1.3.3 人工接種鑒定 2018 年，根據(jù)自然病圃抗性鑒定結(jié)果，從高感、中感、高抗類型中各挑選2 個(gè)品系，以尤金為感病對(duì)照，克新18 號(hào)為抗病對(duì)照，參照邢瑩瑩（2015）的盆栽接種方法進(jìn)行人工接種試驗(yàn)。試驗(yàn)土壤采用滅菌后的草炭土，設(shè)4 次重復(fù)，接種S. scabies 菌種標(biāo)準(zhǔn)菌株。菌株購于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌株編號(hào)CGMCC 4.1765（=ATCC49173）。使用YME 液體培養(yǎng)基28 ℃、200 r · min-1暗培養(yǎng)9 d，用YME 液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌液濃度至5.0 mg · mL-1（FW）。將菌液與土壤均勻混合，菌液和土壤體積比為1∶4，以無菌水為陰性對(duì)照。后期管理參考吳立萍（2017）的方法，種植90 d 后收獲調(diào)查，調(diào)查方法同自然病圃抗性鑒定。

1.3.4 SSR 親緣關(guān)系分析 采用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司的植物基因組DNA 提取試劑盒分別提取20 個(gè)供試品系塊莖的基因組DNA。使用ND-1000 分光光度計(jì)檢測DNA 濃度，并稀釋至100 ng · μL-1，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量。

引物采用黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所病蟲害課題組前期試驗(yàn)篩選得到的9 對(duì)高多態(tài)性SSR引物（表3），PCR 反應(yīng)體系參考吳立萍（2017）的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物使用8%、10%、12%濃度的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，采用銀染法染色，不同引物使用聚丙烯酰胺凝膠的濃度見表3。

參考劉思泱（2010）的方法，統(tǒng)計(jì)膠片條帶，記錄生成“0，1”矩陣，計(jì)算多態(tài)性信息量。利用NTSYS-pc 軟件生成遺傳相似性系數(shù)矩陣，按UPGMA 法進(jìn)行聚類 。

表3 SSR 引物名稱及序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010 和DPS 7.05 軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用NTSYS-pc 軟件分析品系間親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)地塊致病菌鑒定

從土壤和塊莖中共分離純化具有鏈霉菌特征的菌株278 份，其中240 份來自于塊莖，38 份來自于土壤。具有致病力的菌株127 株（表4、圖1），txtAB 基因陽性菌株經(jīng)種類鑒定（圖2）全部屬于Streptomyces scabies 菌種。

表4 試驗(yàn)地塊分離菌株致病力檢測結(jié)果

圖1 txtAB 基因特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜

圖2 S. scabies 特異性引物ScabF/ScabR 擴(kuò)增產(chǎn)物 電泳圖譜

2.2 自然病圃抗性鑒定

對(duì)馬鈴薯品種（系）的瘡痂病指數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，不同品種（系）間的瘡痂病抗性存在顯著性差異。根據(jù)相對(duì)抗病指數(shù)，可將供試品種（系）劃分為4 個(gè)抗病類型（表5）。N11-22-6、N12-39-19、尤金、H04-3-18、N11-40-11、N10-4018、N10-24-2 為高感類型；H09-34012、N12-45-4、N12-39-15、N12-42-18、N12-39-5 為中感類型；N11-46-12、N12-38-1、H04-7-10、克 新18 號(hào)、N11-50-29、N08-21-1、H04-7-23、N08-11-9 為中抗類型；N12-38-7、N08-14-1 為高抗類型。在高抗類型中，N08-14-1 的瘡痂病指數(shù)顯著低于克新18 號(hào)，N12-38-7 的瘡痂病指數(shù)與克新18 號(hào)沒有顯著差異。中抗品系的瘡痂病指數(shù)與克新18 號(hào)無顯著差異。中感品系的瘡痂病指數(shù)均顯著低于尤金，但是和克新18 號(hào)沒有顯著差異。在高感類型中，N11-22-6 的瘡痂病指數(shù)最高，顯著高于尤金，其余高感品種（系）的瘡痂病指數(shù)與尤金無顯著 差異。

2.3 人工接種抗性鑒定

從表6 可以看出，人工接種的參試品種（系）的瘡痂病指數(shù)比自然病圃高，原因可能是人工接種的土壤中致病菌含量高。對(duì)人工接種與自然病圃抗性鑒定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析（圖3），R2為0.946 7，存在極顯著相關(guān)，表明人工接種與自然病圃抗性鑒定結(jié)果一致。

表5 馬鈴薯品種（系）瘡痂病自然病圃抗性鑒定結(jié)果

表6 馬鈴薯品種（系）瘡痂病人工接種抗性鑒定結(jié)果

圖3 人工接種與自然病圃抗性鑒定瘡痂病指數(shù)相關(guān)性 分析結(jié)果

2.4 SSR 親緣關(guān)系分析

2.4.1 SSR 分子標(biāo)記多態(tài)性 20 份馬鈴薯品系的基因組DNA 經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢驗(yàn)，條帶清晰，無明顯拖尾。說明DNA 質(zhì)量較好，可用于下一步SSR-PCR 擴(kuò)增。本試驗(yàn)擴(kuò)增出115 條條帶，其中103 條為多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性比例為89.6%，整體多態(tài)性比例較高（表7、圖4）。

表7 SSR 分子標(biāo)記多態(tài)性信息

圖4 引物STM1104 擴(kuò)增結(jié)果

圖5 20 份馬鈴薯品系基于SSR 的親緣關(guān)系聚類分析圖

2.4.2 SSR 分子標(biāo)記親緣分析 由表8可知，20 份馬鈴薯品系的遺傳相似性系數(shù)變化范圍為0.487 0～0.860 9。整體看來親緣關(guān)系較近。其中N12-45-4與H04-3-18 的遺傳相似性系數(shù)最大； N12-38-1 和N12-39-19 的遺傳相似性系數(shù)最小。

如圖5 所示，可將20 份馬鈴薯品系分成5 大類。第Ⅰ類包括7 個(gè)品系，第Ⅱ類包括6 個(gè)品系，第Ⅲ類包括4 個(gè)品系，第Ⅳ類包括2 個(gè)品系，第Ⅴ類只有1個(gè)品系。

對(duì)比圖5 和表1 的系譜，SSR 遺傳相似性系數(shù)聚類結(jié)果與系譜基本一致。第Ⅰ類中，品系H04-7-23、H04-7-10是全同胞姊妹系，遺傳相似性系數(shù)為0.808 7；第Ⅱ類中，品系H04-3-18 是N12-45-4 的母本，遺傳相似性系數(shù)為0.860 9；第Ⅲ類中，品系N12-39-15、N12-39-19、N12-39-5 是全同胞姊妹系，遺傳相似性系數(shù)為0.773 9～0.782 6。但也有親緣關(guān)系接近，遺傳相似性系數(shù)較小的現(xiàn)象，N12-38-7 與N12-38-1 屬于全同胞姊妹系，但遺傳相似性系數(shù)僅為0.626 1，此結(jié)果區(qū)別于其他幾個(gè)全同胞姊妹系，原因可能是同一雜交組合后代發(fā)生了較大的遺傳重組和變異。

對(duì)比SSR 遺傳相似性系數(shù)聚類結(jié)果和品系抗病性分類結(jié)果（圖5、表5），發(fā)現(xiàn)相同抗病類型的品系通過SSR 遺傳相似性系數(shù)聚類大致上可聚到一起，如高抗和中抗類型的品系絕大部分聚類到第Ⅰ、Ⅳ類中；高感和中感類型的品系大部分聚類到第Ⅱ、Ⅲ類中。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)使用瘡痂病指數(shù)評(píng)價(jià)病情，該方法考慮了病斑面積和病斑深度（類型）兩方面，區(qū)別于病情指數(shù)僅僅調(diào)查病斑面積（張建平 等，2013；孫靜 等，2015）。但是，在抗病性分類方面，僅依據(jù)瘡痂病指數(shù)還是不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)馬鈴薯品種（系）的瘡痂病抗性。比如，在本試驗(yàn)中，瘡痂病病斑類型大多數(shù)是平狀病斑，導(dǎo)致計(jì)算得到的供試品種（系）瘡痂病指數(shù)整體較低。有研究表明，瘡痂病發(fā)病易受環(huán)境影響（何虎翼 等，2017），本試驗(yàn)通過對(duì)比幾個(gè)供試品種（系）在自然病圃和人工接種抗性鑒定試驗(yàn)的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)病環(huán)境下的瘡痂病指數(shù)會(huì)有整體性地浮動(dòng)。因此，本試驗(yàn)采用瘡痂病指數(shù)調(diào)查病情，使用相對(duì)抗病指數(shù)衡量供試品種（系）的相對(duì)抗病性，在抗病性上進(jìn)行分類。

表8 20 份馬鈴薯品系的SSR 遺傳相似性系數(shù)矩陣表

依據(jù)本試驗(yàn)的抗病性分類方法，在自然病圃與人工接種抗性鑒定試驗(yàn)中，尤金均表現(xiàn)為高感類型，克新18 號(hào)分別表現(xiàn)為中抗和中感類型，這與何虎翼等（2017）和邢瑩瑩（2015）的試驗(yàn)結(jié)果基本一致。本試驗(yàn)篩選得到N11-46-12、N12-38-1、H04-7-10、N11-50-29、N08-21-1、H04-7-23、N08-11-9、N12-38-7和N08-14-1共9個(gè)抗病品系，其中品系N08-14-1 抗性最高，明顯高于抗病對(duì)照。

從供試的高世代無性系系譜來看，它們的親本既有中國育成品種，如中薯3 號(hào)，又有國外引進(jìn)品種，如荷蘭的Triplo，美國的Salem，從俄羅斯引進(jìn)的莫斯科列思基的芽變品種延薯4 號(hào)。另外，還包括利用荷蘭種質(zhì)資源育成的無性系，如H04-7-16。但從遺傳相似性系數(shù)變化范圍來看，它們的親緣關(guān)系仍然較近。就本試驗(yàn)而言，可以考慮用第Ⅰ類中的抗病品系H04-7-10、H04-7-23、N11-50-29、N08-11-9 與第Ⅳ類中的抗病品系N12-38-7 和N08-14-1 作為親本雜交進(jìn)行抗瘡痂病品種選育。今后還應(yīng)加大對(duì)國外，特別是發(fā)達(dá)國家和國際馬鈴薯中心材料的收集、保存和利用，進(jìn)一步拓寬育種材料的遺傳基礎(chǔ)。

目前，馬鈴薯瘡痂病抗性機(jī)制尚不明確，還未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的抗性基因（徐建飛和金黎平，2017）。馬鈴薯抗瘡痂病育種的主要工作還是利用自然病圃和人工接種鑒定篩選抗病品種（系），耗時(shí)長，成本高。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，探究親緣關(guān)系與抗病性的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)品系間的SSR 遺傳相似性系數(shù)聚類結(jié)果與瘡痂病抗性分類結(jié)果較相符。在今后的抗瘡痂病育種工作中，可以開發(fā)更多的SSR引物，根據(jù)SSR 遺傳相似性系數(shù)聚類結(jié)果并結(jié)合已知的品種（系）抗性初步篩選，再利用常規(guī)鑒定手段進(jìn)一步篩選，可大大減少工作量。