褪黑素固體脂質(zhì)納米粒的制備及其體外透皮吸收研究Δ

王錫輝，王亞平，王向宇，宋宜蕾，王興榮，王建澤，郝吉福（山東第一醫(yī)科大學(xué)/山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安 271016）

褪黑素（Melatonine，MT）是由腦松果體分泌的一種內(nèi)源性神經(jīng)激素，又名松果體素、褪黑色素，具有改善睡眠質(zhì)量、調(diào)整人體晝夜節(jié)律、抗氧化及調(diào)節(jié)免疫等生理作用[1]。然而，由于MT的半衰期短，吸收差且不穩(wěn)定，口服存在不可避免的首關(guān)效應(yīng)，因此設(shè)計(jì)合適的藥物遞送系統(tǒng)以提高該藥的吸收效率是目前藥劑學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題之一[2]。固體脂質(zhì)納米粒（SLNs）是以天然或合成的固態(tài)類脂為材料，將藥物包裹或鑲嵌在類脂核中，制成的具有緩釋性和靶向性的且粒徑＜1 000 nm的納米遞送系統(tǒng)[3]。由于SLNs的粒度效應(yīng)可明顯提高藥物的透皮吸收程度，故常被作為藥物經(jīng)皮遞送系統(tǒng)的載體[4-5]。為此，本研究以MT為模型藥物，山崳酸甘油酯為油相，泊洛沙姆188（F188）為乳化劑，通過熔融乳化法[6]制備MT固體脂質(zhì)納米粒（MT-SLNs），并采用Franz擴(kuò)散池法考察該制劑的體外透皮行為，以期為后續(xù)MT經(jīng)皮遞送系統(tǒng)的深入研究提供理論支持。

1 材料

1.1 儀器

VP-10A型高效液相色譜儀、IRAFFINITY型紅外光譜儀（日本Shimadzu公司）；Nano-S 90型激光粒度分析儀（英國Malvern公司）；RYJ-6A型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；JEM-1200EX型透射電鏡（日本JEOL公司）；JY92-2D型超聲細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；EYELA FDU-1200型凍干機(jī)（日本EYELA公司）；K30型高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）；ME104T型分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

MT原料藥（上海阿拉丁生化科技股份公司，批號(hào)：20170923，純度：98%）；MT對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：520023-201301，純度：99.8%）；山崳酸甘油酯（批號(hào)：20161226）、F188（批號(hào)：20170118）均購自北京鳳禮精求商貿(mào)有限公司；超濾離心管（30 kDa，美國Millipore公司）；聚山梨酯80（Tween-80，天津巴斯夫化工股份有限公司）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，6周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20140007。

2 方法與結(jié)果

2.1 MT-SLNs與空白SLNs的制備

采用熔融乳化法[6]制備MT-SLNs。精密稱取MT原料藥50 mg、山崳酸甘油酯500 mg，溶于無水乙醇5 mL中，水浴加熱至85℃至熔融，作為油相；另取乳化劑F188 0.2 g，溶于水20 mL中，作為水相，水浴加熱至上述相同溫度，將水相與油相混合并攪拌均勻，于85℃保溫條件下置超聲細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲（功率：400 W，頻率：20 kHz）5 min，直至反應(yīng)體系由白色乳濁液變?yōu)榈{(lán)色澄清液體，繼續(xù)攪拌以揮干有機(jī)溶劑，隨后將其迅速轉(zhuǎn)移至冰水浴中進(jìn)行固化，即得MT-SLNs（含MT原料藥2.5 mg/mL、山崳酸甘油酯25 mg/mL、F188 1%）。同法制備不含MT的空白SLNs，備用。

2.2 MT-SLNs的表征

圖1 MT-SLNs的透射電鏡圖（×20 000）Fig 1 TEM image of MT-SLNs（×20 000）

圖2 MT-SLNs的粒徑分布Fig 2 Particle size distribution of MT-SLNs

2.2.1 形態(tài)觀察與粒徑檢測 取“2.1”項(xiàng)下MT-SLNs適量，用水稀釋后，使用透射電鏡觀察其形態(tài)，使用激光粒徑分析儀檢測其粒徑分布。結(jié)果，所得MT-SLNs呈圓球狀，且未見聚集現(xiàn)象發(fā)生；其平均粒徑為（67.88±0.17）nm，多分散指數(shù)為0.188±0.001，詳見圖1、圖2。

2.2.2 紅外光譜檢測 取“2.1”項(xiàng)下MT-SLNs適量，經(jīng)冷凍干燥后，取凍干粉末2 mg，加入干燥的溴化鉀10 mg，研磨后壓片，置于紅外光譜儀下進(jìn)行掃描，記錄紅外光譜圖，并同法測定MT原料藥。結(jié)果，MT原料藥在3304 cm－1處可見N—H伸縮振動(dòng)的特征吸收峰，在1 624 cm－1處可見N—H彎曲振動(dòng)的特征吸收峰，在2 989、2 927 cm－1處可見飽和C—H伸縮振動(dòng)的特征吸收峰，在1 587、1 440 cm－1處可見苯環(huán)C—H伸縮振動(dòng)的特征吸收峰。制成SLNs后，上述N—H伸縮、彎曲振動(dòng)的特征吸收峰消失，且苯環(huán)C—H伸縮振動(dòng)的特征吸收峰紅移至1 750 cm－1，詳見圖3。

圖3 MT-SLNs和MT原料藥的紅外光譜圖Fig 3 IR spectra of MT-SLNs and MT raw material

2.3 MT含量檢測方法的建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Aquasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（50∶50，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：223 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3.2 溶液的配制 精密稱取MT對照品5.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，得MT質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液。取“2.1”項(xiàng)下MT-SLNs 0.1 mL，用甲醇溶解并定容至10 mL，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）15 min后，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。取空白SLNs適量，按供試品溶液配制方法制備陰性對照溶液。

2.3.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，MT的保留時(shí)間為5.8min，理論板數(shù)按MT計(jì)不低于2 000，空白SLNs不干擾待測物的測定，詳見圖4。

圖4 高效液相色譜圖Fig 4 HPLC chromatograms

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及定量限、檢測限的考察 精密稱取MT對照品25.0 mg，置于10 mL量瓶中，加入甲醇適量，振搖使溶解，以流動(dòng)相定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，以流動(dòng)相稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為0.78、3.9、7.8、19.5、39.06、78.125 μg/mL的系列對照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測物質(zhì)量濃度（c，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 A＝127.47c－4.30（R2＝0.999 9）。結(jié)果，MT檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.78～78.125 μg/mL；定量限為0.78 μg/mL（信噪比為10∶1），檢測限為0.236 μg/mL（信噪比為3∶1）。

2.3.5 方法學(xué)考察 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液20 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)測定5次，記錄峰面積。結(jié)果，MT峰面積的RSD為1.38%（n＝5），表明該方法精密度良好。按“2.3.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液（MT質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL），分別于室溫下放置0、2、4、8 h后，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，各質(zhì)量濃度樣品MT峰面積的RSD為2.73%（n＝4），表明其室溫放置8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。按“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行制備供試品溶液5份，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，MT峰面積的RSD為2.47%（n＝5），表明該方法重復(fù)性良好。按“2.1”項(xiàng)下方法制備不含MT的空白SLNs，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度（1.0、5.0、25.0 μg/mL）的MT對照品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理后，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計(jì)算空白回收率。每質(zhì)量濃度平行操作5次。結(jié)果，各樣品的平均空白回收率分別為101.17%、98.92%、99.13%，RSD分別為3.56%、2.96%、1.36%（n＝5）。

2.4 包封率（EE）和載藥量（DL）的測定

采用超濾離心法測定MT-SLNs的包封率及載藥量。精密量取“2.1”項(xiàng)下MT-SLNs 0.5 mL，置于超濾離心管中，4 000×g離心15 min，收集濾液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算未被包封（即游離）的褪黑素質(zhì)量（m游離）；再精密量取“2.1”項(xiàng)下MT-SLNs 0.5 mL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇定容，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）15 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過后，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算褪黑素總質(zhì)量（m總），按公式計(jì)算EE和DL：EE＝[（m總－m游離）/m總]×100%，DL＝[（m總－m游離）/m酯]×100%（式中，“m酯”為處方中山崳酸甘油酯的質(zhì)量）。結(jié)果，本研究所得MT-SLNs的EE為（87.54±5.31）%，DL為（8.42±0.78）%。

2.5 MT-SLNs的體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)

2.5.1 離體皮膚制備 于小鼠腹部涂抹脫毛膏行脫毛處理后，用生理鹽水洗凈，飼養(yǎng)24 h后處死，剝離無毛的腹部皮膚，去除皮下脂肪，用生理鹽水洗凈，以濾紙吸干水分，再用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）漂洗至洗液澄清，用濾紙吸干后，備用[7]。

2.5.2 體外透皮吸收試驗(yàn) 在直立式Franz擴(kuò)散池中進(jìn)行透皮吸收試驗(yàn)，擴(kuò)散池置于藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀中，于37℃恒溫循環(huán)水浴中保溫。將“2.4.1”項(xiàng)下處理好的小鼠離體皮膚固定在供給池和接收池中間，角質(zhì)層部分朝向供給池，其有效滲透面積為3.5 cm2。以0.1%Tween-80-生理鹽水溶液作為接收液，接收池容積為6.5mL。取“2.1”項(xiàng)下MT-SLNs 1.0 mL，加至供給池小鼠離體皮膚（5張）的角質(zhì)層表面，以相同質(zhì)量濃度的MT原料藥（將MT原料藥5.0 mg分散到水2.0 mL中所得的混懸液）作為對照（離體皮膚5張），在300 r/min的攪拌條件下，分別于0.5、1、2、3、4、6、8、10 h時(shí)吸取接收液0.5 mL，并于取樣后補(bǔ)加相同體積的接收液。吸出的接收液經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過后，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，根據(jù)回歸方程計(jì)算MT的質(zhì)量濃度，并按如下公式計(jì)算單位面積的累積滲透量（Q）：

圖5 MT-SLNs和MT原料藥的體外滲透曲線（n＝5）Fig 5 Percutaneous penetration curves in vitro of MTSLNs and MT raw material（n＝5）

式中，“S”為有效滲透面積，“V”為接收室中接收液的體積，“Vi”為每次取樣的體積，“ci”為第i次至上次取樣時(shí)接收液中藥物的累積質(zhì)量濃度；“cn”為該次取樣時(shí)接收液中藥物的質(zhì)量濃度。采用Excel 2007軟件以Q對時(shí)間t作圖，并進(jìn)行線性回歸，得動(dòng)力學(xué)擬合方程。該方程的斜率即為穩(wěn)態(tài)透過速率[Jss，μg/（h·cm2）]，回歸曲線與x軸的交點(diǎn)即為滯后時(shí)間（t1ag，h）。采用Prism 6.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見圖5、表1。

表1 MT-SLNs和MT原料藥的經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)擬合方程及滲透參數(shù)（±s，n＝5）Tab 1 Percutaneous penetration kinetic fitting equations and parameters of MT-SLNs and MT raw material（±s，n＝5）

表1 MT-SLNs和MT原料藥的經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)擬合方程及滲透參數(shù)（±s，n＝5）Tab 1 Percutaneous penetration kinetic fitting equations and parameters of MT-SLNs and MT raw material（±s，n＝5）

注：與MT原料藥組比較，＊P＜0.01Note：vs.MT raw material group，＊P＜0.01

tlag，h 1.57±0.37 0.17±0.01＊組別MT原料藥MT-SLNs動(dòng)力學(xué)擬合方程Q＝12.982t－20.324 Q＝31.723t－5.388 R2 0.999 3 0.998 7 Jss，μg/（h·cm2）10.32±3.24 31.71±2.78＊

由圖5、表1可見，MT-SLNs及其原料藥的透皮吸收行為均符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)釋放規(guī)律。其中，MT-SLNs的Jss為（31.71±2.78）μg/（h·cm2），顯著高于 MT 原料藥的（10.32±3.24）μg/（h·cm2）；MT-SLNs的tlag為（0.17±0.01）h，顯著短于MT原料藥的（1.57±0.37）h，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

MT作為一種廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)的生理節(jié)律性調(diào)節(jié)因子，主要由腦松果體在夜間分泌，在睡眠過程中發(fā)揮重要作用，有助于改善存在睡眠延遲、睡眠障礙人群的睡眠質(zhì)量，亦有助于調(diào)整旅行者、宇航員或夜班工作人員的時(shí)差[8]。然而由于MT的半衰期較短（t1/2＜45 min）、口服吸收影響因素較多（如胃的排空及排空速率、食物及胃腸道代謝等），加之其不可避免的首關(guān)效應(yīng)，使得MT口服給藥效果欠佳[9]。皮膚作為機(jī)體最大的器官，經(jīng)皮遞送系統(tǒng)可明顯減輕MT的肝消除程度，并提高其生物利用度，使其更接近于內(nèi)源性MT的釋放水平[3]。盡管經(jīng)皮給藥有許多優(yōu)點(diǎn)，然而由于皮膚角質(zhì)層具有“磚泥結(jié)構(gòu)”的屏障特性，故如何有效克服角質(zhì)層的屏障作用是經(jīng)皮遞送系統(tǒng)研究領(lǐng)域需要解決的問題[10]。考慮到MT的分子量較?。ǚ肿恿繛?32），易于透過皮膚角質(zhì)層，同時(shí)在MT的分子結(jié)構(gòu)中含有親水和親脂基團(tuán)，有利于其透過皮膚的生物膜而被吸收，故該藥可被設(shè)計(jì)為經(jīng)皮遞送系統(tǒng)藥物[11-12]。有研究表明，可將脂質(zhì)體、醇質(zhì)體、聚合物納米粒等作為MT的載體用于其經(jīng)皮遞送系統(tǒng)的制備，但上述載體具有一定的流動(dòng)性，容易導(dǎo)致藥物的泄漏[11]。SLNs采用生物相容性好的脂質(zhì)材料，藥物可被鑲嵌或包載于固態(tài)的脂質(zhì)顆粒中，可使藥物泄漏減少、經(jīng)皮遞送系統(tǒng)穩(wěn)定性提高[3]。因此，本課題組將MT設(shè)計(jì)為SLNs以更好地改善其透皮吸收特征。

本研究采用熔融乳化法制備SLNs。首先，將油相加熱，當(dāng)超過脂質(zhì)熔點(diǎn)后，油相可變?yōu)榫坏囊后w；隨后將藥物溶解于液態(tài)的油相中，在乳化劑的作用下，使油相與同溫度的水相形成水包油型乳劑；最后快速降溫使液態(tài)的油相固化成固態(tài)的微粒，從而將藥物包裹于脂質(zhì)中，最終制得澄清、透明且?guī)в形⑺{(lán)色乳光的MT-SLNs。粒徑檢測結(jié)果顯示，本研究制得的MT-SLNs的平均粒徑為（67.88±0.17）nm，多分散指數(shù)為0.188±0.001，提示所制備的MT-SLNs分布比較均勻。紅外光譜檢測結(jié)果表明，MT的特征吸收峰消失或紅移，提示其已被包括在固體脂質(zhì)中。經(jīng)HPLC法檢測，本研究制得的MT-SLNs的EE為（87.54±5.31）%，DL為（8.42±0.78）%。由于MT具有較高的脂溶性，而所用到的脂質(zhì)材料山崳酸甘油酯能夠和模型藥物MT之間具有較好的相容性，可將MT鑲嵌或包裹在脂質(zhì)材料所形成的骨架中，故EE和DL較高，提示SLNs可作為模型藥物MT經(jīng)皮遞送系統(tǒng)的載體。

透皮試驗(yàn)結(jié)果顯示，將MT制備成SLNs后，Jss較MT原料藥提高了約3.07倍，tlag縮短至0.17 h左右，表明將MT制成SLNs可顯著提高其透皮性能，并能縮短滯后時(shí)間，從而有助于其療效的發(fā)揮。筆者分析原因可能包括：首先，SLNs顆粒更易黏附在皮膚的角質(zhì)層上，形成具有封閉效應(yīng)的藥物存貯庫，在皮膚內(nèi)外兩側(cè)維持較高的濃度梯度，使得所包載的藥物分子可擴(kuò)散至更深的皮膚層；其次，粒徑大小在100 nm以下的SLNs具有更強(qiáng)的黏附性以及更大的接觸面積，可進(jìn)一步促進(jìn)藥物透過皮膚內(nèi)流；此外，SLNs可與給藥部位的角質(zhì)層發(fā)生相互作用，引發(fā)脂質(zhì)重排，從而減小藥物分子滲透過皮膚角質(zhì)層的阻力[13]。由此可見，將MT制成SLNs后，該藥的體外透皮效果得到明顯提高。

綜上所述，本研究可為MT經(jīng)皮遞送系統(tǒng)的制備和優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)，在后續(xù)的工作中將開展經(jīng)皮給藥后體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的相關(guān)研究。