HPLC法同時測定活血促愈膠囊中2種黃酮類和4種菲醌類成分的含量Δ

陳丹，李柯，盧茂芳，侯茜，李若存（1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南湘潭41110；.湖南省中醫(yī)藥研究院，長沙 41001；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 41008）

活血促愈膠囊是由三七、積雪草、丹參、槐米等藥材組成的中藥6類新藥，具有活血化瘀、消腫止痛的功效，臨床用于急性軟組織損傷及骨折[1-2]。其中，三七為方中君藥，積雪草為臣藥，丹參、槐米分別為佐藥、使藥。本課題組前期研究已建立了同時測定活血促愈膠囊中三七、積雪草中5種皂苷類成分含量的高效液相色譜法（HPLC）[3]。該方中丹參主要含有菲醌類成分（如丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ等），為活血化瘀的活性成分；槐米中的黃酮類成分（如蘆丁、槲皮素、山柰酚-3-O-蕓香糖苷等）具有良好的消腫止痛作用，均為該方的主要活性成分[4]。為了進(jìn)一步提高質(zhì)量控制水平，本試驗建立了同時測定該方中蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA等6種成分的HPLC法，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT型HPLC儀（包括LC-20AT型二元泵、SPD-20A型紫外檢測器、7725i-049型手動進(jìn)樣器）、LabSolutions 6.50 SP1系列工作站（日本Shimadzu公司）；XPE105型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；HX-06型超聲波清洗器（武漢恒信世紀(jì)科技有限公司）。

1.2 藥品、藥材與試劑

活血促愈膠囊（湖南省中醫(yī)藥研究院制劑室自制，批號：20161210、20170305、20170312、20170319，規(guī)格：0.56 g/粒，人參皂苷Rg1含量：≥4.0mg/粒，丹參酮ⅡA含量：≥0.4 mg/粒）；三七藥材（批號：20160501、20160820、20161001、20161212）、積雪草藥材（批號：20160612、20160911、20161105、20170110）、丹 參 藥 材（ 批 號 ：20160515、20160725、20170118、20170126）、槐米藥材（批號：20160501、20160911、20161212、20170104）均購自湖南上藥九旺醫(yī)藥有限公司，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院李若存研究員鑒定，三七為五加科植物三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]的干燥根和根莖、積雪草為傘形科植物積雪草[Centella asiatica（L.）Urb.]的干燥全草、丹參為唇形科植物丹參[Salvia miltiorrhiza Bge.]的干燥根和根莖、槐米為豆科植物槐[Sophora japonica L.]的干燥花蕾及花；蘆丁對照品（批號：100080-200707，純度：90.5%）購自中國食品藥品檢定研究院，山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品（批號：MUST-17040507，純度：98.16%）、二氫丹參酮Ⅰ對照品（批號：MUST-17032705，純度：98.40%）、隱丹參酮對照品（批號：MUST-17030403，純度：99.34%）、丹參酮Ⅰ對照品（批號：MUST-17030210，純度：99.09%）、丹參酮ⅡA對照品（批號：MUST-17101811，純度：99.33%）均購自成都曼思特生物科技有限公司；聚酰胺（30～60目，柱層析用，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20160118）；乙腈為色譜純，甲醇、乙醇均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～10 min，15%A；10～30 min，15%A→21%A；30～60 min，21%A→75%A；60～75 min，75%A→15%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：20℃；檢測波長：270 nm；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA對照品適量，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度分別為8 606.6、766.6、640.6、295.2、256.0、335.7 μg/mL的單一對照品貯備液。分別精密吸取上述各單一對照品貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度分別為 860.66、76.66、64.06、29.52、25.60、33.57 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取活血促愈膠囊內(nèi)容物，研細(xì)（過三號篩），精密稱取0.7 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加甲醇50 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加適量水溶解，上樣于已處理好的聚酰胺柱（3 g，30～60目，內(nèi)徑1.2 cm），水洗脫至無色后，加乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液30 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的制備工藝和配方比例，分別制備缺丹參藥材、缺槐米藥材的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法分別制成缺丹參藥材和缺槐米藥材的陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，在該色譜條件下，各待測成分之間、待測成分與雜質(zhì)峰之間得到分離，6種成分的分離度＞1.5，理論板數(shù)以蘆丁計均大于5 000，詳見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于1 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得系列混合對照品溶液。精密量取上述混合對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性關(guān)系考察結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1 Results of linear range investigation

2.5 檢測限與定量限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限；當(dāng)信噪比為10∶1時，得定量限。結(jié)果，蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的檢測限分別為0.08、0.01、0.01、0.01、0.01、0.01 μg/mL，定量限分別為 0.27、0.02、0.03、0.03、0.03、0.03 μg/mL。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA峰面積的RSD分別為0.78%、1.22%、1.67%、1.87%、1.92%、1.16%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20161210）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA峰面積的RSD分別為1.32%、1.25%、1.64%、1.98%、1.51%、1.49%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

取樣品（批號：20161210）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算樣品含量。結(jié)果，蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的平均含量分別為37.82、1.93、1.03、1.18、0.50、1.07 mg/g，RSD 分別為 1.57%、1.92%、1.20%、1.41%、1.64%、1.09%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量樣品（批號：20161210）適量，共6份，分別加入蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA對照品溶液[此溶液的濃度是根據(jù)取樣量中該成分的含量，按質(zhì)量比1∶1配制]，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 2Results of recovery tests（n＝6）

2.10 耐用性試驗

2.10.1 色譜柱考察 取樣品（批號：20161210）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件[色譜柱分別為Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm)、TECHI C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算樣品含量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，當(dāng)色譜柱發(fā)生一定程度波動時，本法能滿足試驗要求，提示其耐用性良好。

2.10.2 柱溫考察 取樣品（批號：20161210）適量，按

表3 耐用性試驗結(jié)果Tab 3 Results of durability tests

“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件（柱溫分別為18、20、22℃）進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算樣品含量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，當(dāng)柱溫發(fā)生一定程度波動時，本法能滿足試驗要求，提示其耐用性良好。

2.11 樣品含量測定

取4批樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 4Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

以2015年版《中國藥典》（一部）丹參、槐米含量測定項下方法[5]為基礎(chǔ)，結(jié)合文獻(xiàn)方法[6-12]同時測定了蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA等6種成分的含量。

3.1 測定成分的選擇

本方中丹參為佐藥、槐米為使藥。研究表明，丹參所含的二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA均為菲醌類成分，均能明顯提高骨折愈合區(qū)和成骨細(xì)胞數(shù)目，能阻止白細(xì)胞過度的游出和聚集，防止溶酶體酶、氧化代謝產(chǎn)物等過多的釋放，減輕組織損傷，可控制炎癥的發(fā)生；對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和β-內(nèi)酰胺酶陽性的金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)抑菌作用，其中隱丹參酮作用最強(qiáng)[13-15]。槐米所含的蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷均為黃酮類成分，其中蘆丁能降低毛細(xì)血管的異常通透性、脆性，能維持血管抵抗力，可用于出血癥的治療和預(yù)防；山柰酚-3-O-蕓香糖苷能抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，為活血化瘀的有效成分[16]。

本處方中4味藥材所含主要活性成分是皂苷類、菲醌類及黃酮類。本課題組前期已對三七、積雪草中皂苷類成分的定量測定進(jìn)行研究；二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA是丹參中的主要成分，2015年版《中國藥典》（一部）丹參含量測定的指標(biāo)就是丹參酮類[5]；蘆丁是槐米的含量測定指標(biāo)[5]，山柰酚-3-O-蕓香糖苷為槐米中的另一主要黃酮類成分[17]。因此，最終選擇蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA等6種成分進(jìn)行含量測定。

3.2 檢測波長的選擇

本研究前期分別對蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA等6種成分進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果，蘆丁的最大吸收波長為257 nm，山柰酚-3-O-蕓香糖苷的最大吸收波長為344 nm，丹參酮ⅡA與隱丹參酮的最大吸收波長為270 nm，二氫丹參酮Ⅰ的最大吸收波長為240 nm，丹參酮Ⅰ的最大吸收波長為245 nm，各成分最大吸收波長各不相同，故選擇相差較大的3個波長（245、270、344 nm），對同一供試品進(jìn)行測定，對基線、分離度、理論板數(shù)和各成分含量進(jìn)行綜合評價。結(jié)果，在上述波長下檢測，各色譜峰均能達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，柱效好；在270 nm波長下檢測時，各成分含量均較高，故最終選擇270 nm作為檢測波長。

3.3 流動相的篩選

本研究前期參照2015年版《中國藥典》（一部）丹參含量測定項下的流動相[5]，比較了乙腈-水、乙腈-0.02%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液的分離效果。結(jié)果，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相的色譜峰分離度及峰形最好。經(jīng)反復(fù)摸索，本研究最終選定了上述流動相梯度，結(jié)果6種成分均能得到較好的分離。

3.4 供試品溶液制備方法的選擇

丹參中脂溶性成分主要為菲醌類化合物，槐米中則主要含黃酮類化合物。本研究前期參照2015年版《中國藥典》（一部）丹參與槐米藥材含量測定項下的方法[5]，采用甲醇超聲處理，超聲提取液直接進(jìn)樣分析。結(jié)果，提取液中成分復(fù)雜，呈現(xiàn)出多個色譜峰，且待測成分與相鄰色譜峰無法實現(xiàn)基線分離。因此，依據(jù)黃酮類、菲醌類化合物與聚酰胺形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附的特性，采用聚酰胺柱對供試品進(jìn)行分離、純化[18-19]。本研究前期對聚酰胺的用量、色譜柱內(nèi)徑及長度、洗脫劑的種類及用量等進(jìn)行了篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選用聚酰胺柱（3 g，30～60目，內(nèi)徑1.2 cm）、以乙醇30 mL進(jìn)行洗脫時，供試品溶液色譜圖中的雜質(zhì)峰較少，各色譜峰分離度均大于1.5，因此最終選擇此法作為本品供試液的制備方法。

3.5 含量測定結(jié)果分析

由表4可知，每批成品中黃酮類成分的含量均高于菲醌類成分，均以蘆丁含量最高，且蘆丁批間差異最小，RSD為0.97%，山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量的RSD為2.85%，說明黃酮類化合物較穩(wěn)定。丹參中4種菲醌類成分含量批間差異較大，尤其是二氫丹參酮Ⅰ和丹參酮Ⅰ（RSD分別為5.02%和9.81%），且丹參酮Ⅰ含量最低。由于不同來源的丹參藥材及飲片中丹參酮類成分含量差異明顯，因此有必要對丹參的來源進(jìn)行嚴(yán)格控制。

綜上所述，本研究所建立的HPLC法靈敏、快速、操作簡便、重復(fù)性好，可用于活血促愈膠囊中蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA含量的同時測定。