香菊顆粒中黃芪甲苷含量測定方法的改進及其與原方成分的一致性研究Δ

孫晨曦，葛鼎，王素梅，郭康，王舉濤#（.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥300；.陜西雪龍海姆普德藥業(yè)股份有限公司，陜西 渭南 74000）

香菊顆粒（國藥準(zhǔn)字：Z10980117）是根據(jù)民間驗方采用現(xiàn)代化制劑技術(shù)制成的顆粒劑型中成藥，主要由化香樹果序、夏枯草、黃芪、防風(fēng)、甘草、野菊花、白芷、辛夷、川芎等9種藥材經(jīng)傳統(tǒng)煎煮工藝提取后，再加入適量輔料而制成；其具有辛散祛風(fēng)、清熱解毒、活血化瘀、通竅止痛、消腫排膿等功效，以及鎮(zhèn)痛、抗炎、增強免疫、廣譜抗菌、抗病毒等藥理活性，在臨床上主要用于急慢性鼻炎、鼻竇炎的癥狀緩解與治療[1-9]。香菊顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)：新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》第38冊，該標(biāo)準(zhǔn)主要是采用薄層掃描法測定黃芪甲苷含量[10]，然而在以往實踐過程中發(fā)現(xiàn)該方法重現(xiàn)性較差?；诖?，本研究在以往相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法（HPLC-ELSD）對黃芪甲苷進行含量測定，以進一步完善香菊顆粒的質(zhì)量控制方法。

目前市面上香菊顆粒的同方制劑還有香菊膠囊、香菊片，且已廣泛用于臨床。有研究表明，現(xiàn)代化中藥工業(yè)藥劑生產(chǎn)過程會對古方或經(jīng)驗方的有效成分產(chǎn)生影響[11]，而中藥復(fù)方制劑功效發(fā)揮的基礎(chǔ)正是原方藥材中藥理活性成分的保留，因此通過對比中藥制劑在水中的釋藥情況，可反映不同劑型間對原方成分種類和含量的保留程度?？紤]到中藥復(fù)方的化學(xué)成分較為復(fù)雜，是多個組分之間相互作用以共同發(fā)揮藥效，僅以單個或幾個有效成分對其進行質(zhì)量控制無法完全體現(xiàn)中藥復(fù)方的整體性，因此建立中藥制劑釋放成分的特征指紋圖譜并評價其相似度，可更全面地評價不同制劑對原方成分的保留情況；同時，結(jié)合對不同香菊制劑與原方提取物中主要有效成分黃芪甲苷的釋放度的比較，可從整體和單一成分的雙重角度，評價原方進行現(xiàn)代化工藝制劑的有效性、合理性和一致性，從而為確保中藥復(fù)方的臨床療效提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent公司）；Alltech 2000型蒸發(fā)光散射（ELSD）檢測器[美國奧泰科技（中國）有限公司]；LC-10A型HPLC儀（日本Shimadzu公司）；B135-S型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ220型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

市售香菊顆粒（陜西雪龍海姆普德藥業(yè)股份有限公司，批號：171114）；香菊制劑原方干膏粉（批號：YFGGF01、YFGGF02、YFGGF03、YFGGF04、YFGGF05、YFGGF06）、缺黃芪原方干膏粉（批號：YXYFGGF01）均為本課題組按處方工藝煎煮提取、干燥后制得；香菊顆粒（批號：XJKL01、XJKL02、XJKL03）、香菊膠囊（批號：XJJN01、XJJN02、XJJN03）、香菊片（批號：XJP01、XJP02、XJP03）均為本課題組以香菊制劑原方干膏粉添加相應(yīng)輔料制得；糊精、蔗糖粉、甘露醇等藥用輔料均購自河南魯爾康藥業(yè)有限公司。

2 黃芪甲苷含量測定方法的改進

2.1 HPLC-ELSD法測定香菊顆粒中黃芪甲苷的含量

參考2015年版《中國藥典》（一部）“黃芪”項含量測定方法[12]與相關(guān)文獻[13-15]，采用HPLC-ELSD法測定香菊顆粒中黃芪甲苷的含量。

2.1.1 黃芪甲苷對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品5.38 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.538 mg的對照品溶液。

2.1.2 樣品溶液與陰性樣品溶液的制備 （1）取市售香菊顆粒1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加水飽和正丁醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜置過夜后超聲提?。üβ剩?00 W，頻率：40 kHz）1.0 h并適當(dāng)振搖；放冷，用水飽和正丁醇補足減失質(zhì)量，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，以40%氨水充分洗滌2次，每次40 mL；取上層正丁醇液減壓蒸干，回收溶劑；殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得樣品溶液。（2）取缺黃芪原方干膏粉，按處方工藝制得缺黃芪香菊顆粒陰性樣品，取1.0 g，同“（1）”項下方法配制陰性樣品溶液。

2.1.3 色譜條件與ELSD參數(shù) （1）色譜條件：采用1260型HPLC儀測定。色譜柱為Epic C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（32∶68，V/V）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣體積為10 L。（2）ELSD參數(shù)：漂移管溫度為115℃；噴嘴溫度為105℃；載氣為凈化壓縮空氣；載氣流速為3 L/min；光電管信號放大倍數(shù)為2倍。

2.1.4 系統(tǒng)適用性考察 分別取“2.1.1”“2.1.2”項下對照品溶液、樣品溶液、陰性樣品溶液各適量，按“2.1.3”項下條件進樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，黃芪甲苷保留時間為24.790 min，分離度為3.89，理論板數(shù)為7 842，且陰性樣品對測定無干擾，詳見圖1。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密稱取黃芪甲苷對照品4.20mg，置于2 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，制得質(zhì)量濃度為2.10 mg/mL的對照品溶液Ⅰ；精密吸取對照品溶液Ⅰ適量，以甲醇梯度稀釋，制得質(zhì)量濃度分別為1.05、0.52、0.26、0.13 mg/mL的系列對照品溶液Ⅱ～Ⅴ。取上述對照品溶液Ⅰ～Ⅴ，按“2.1.3”項下條件進樣分析，記錄色譜圖。以黃芪甲苷質(zhì)量濃度的常用對數(shù)值（x）為橫坐標(biāo)、色譜峰面積的常用對數(shù)值（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程為y＝1.064 4x+5.895 7（r＝0.999 1），表明黃芪甲苷檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.13～2.10 mg/mL。

2.1.6 精密度試驗 取同一樣品溶液（批號：171114），按“2.1.3”項下條件連續(xù)進樣分析6次。結(jié)果，黃芪甲苷峰面積的RSD為0.64%（n＝6），表明儀器進樣精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 取同一批樣品（批號：171114），共6份，按“2.1.2”項下方法配制樣品溶液，再按“2.1.3”項下條件進樣分析，以外標(biāo)兩點法計算黃芪甲苷含量。結(jié)果，黃芪甲苷的平均含量為0.398 mg/g，RSD為1.93%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

現(xiàn)場植被群落調(diào)查方法采用樣方法，分別在子壩平臺、子壩邊坡和尾礦庫庫面三個區(qū)域選擇12個經(jīng)過復(fù)墾的人工群落進行。樣方內(nèi)盡量包含群落中絕大多數(shù)植物，其中草本采用1×1=1 m2的樣方，灌木采用4×4=16 m2的樣方，喬木采用10×10=100 m2的樣方。

圖1 黃芪甲苷的系統(tǒng)適用性色譜圖Fig 1 System suitability chromatograms of astragalosideⅣ

2.1.8 回收率試驗 精密稱取黃芪甲苷對照品4.28 mg，置于20 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，制得質(zhì)量濃度為0.214 mg/mL的加樣回收對照溶液。精密量取該對照溶液1.0 mL，共6份，分別置于6個錐形瓶中（編號1～6），水浴蒸干后，分別加入已知黃芪甲苷含量的樣品顆粒（批號：171114，黃芪甲苷含量：0.398 mg/g）約0.5 g，按“2.1.2”項下方法配制樣品溶液，再按“2.1.3”項下條件進樣分析，以外標(biāo)兩點法計算黃芪甲苷含量，并計算加樣回收率。結(jié)果，黃芪甲苷的平均加樣回收率為97.66%，RSD為1.01%（n＝6），表明本方法準(zhǔn)確度良好，詳見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of recovery tests

2.1.9 穩(wěn)定性試驗 取同一樣品溶液（批號：171114），在室溫25℃、相對濕度45%的條件下放置，并按“2.1.3”項下條件每隔2 h進樣測定1次，共測定6次。結(jié)果，黃芪甲苷峰面積RSD為2.16%（n＝6），表明樣品溶液在上述條件下放置10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 新建方法與原標(biāo)準(zhǔn)含量測定方法的比較

取市售香菊顆粒（批號：171114）適量，平行操作3份，分別采用本文建立的HPLC-ELSD法和原標(biāo)準(zhǔn)的薄層掃描法[9]測定黃芪甲苷的含量。結(jié)果，HPLC-ELSD法所測黃芪甲苷含量分別為0.398、0.394、0.402 mg/g，平均含量為0.398 mg/g（RSD＝1.01%，n＝3）；薄層掃描法所測黃芪甲苷含量分別為0.374、0.399、0.381 mg/g，平均含量為0.385 mg/g（RSD＝3.35%，n＝3），表明HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷含量較薄層掃描法偏差更小。

3 不同香菊制劑與原方成分一致性比較

3.1 不同香菊制劑與原方干膏粉的水中釋放成分特征圖譜比較

3.1.1 色譜條件 采用LC-10A型HPLC儀測定。色譜柱：Thermo Hypersil GOLDTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A；10～50 min，10%A→18%A；50～70 min，18%A；70～95 min，18%A→25%A；95～110 min，25%A→40%A；110～120 min，40%A；120～135 min，40%A→70%A；135～140 min，70%A→10%A；140～150 min，10%A）；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：5μL。

3.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取升麻素苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸、迷迭香酸、蒙花苷、木蘭脂素的對照品適量，加甲醇分別制成質(zhì)量濃度均為50μg/mL的單一對照品溶液，以0.22μm濾膜濾過，即得。

3.1.3 供試品溶液的制備 稱取原方干膏粉（批號：YFGGF01）0.6 g，并根據(jù)不同制劑處方中輔料添加量稱取均相當(dāng)于等量干膏粉的自制香菊顆粒（批號：XJKL01）、香菊膠囊（批號：XJJN01）內(nèi)容物、香菊片（批號：XJP01）粉末各適量，平行操作6份，精密稱定，分別加入37℃的水150 mL，攪拌使分散均勻，過濾；精密移取15 mL濾液蒸干，加甲醇定容至1 mL，以0.22 μm濾膜過濾，即得。

3.1.4特征峰指認(rèn)分別取“3.1.2”“3.1.3”項下的對照品溶液、供試品溶液各適量，按“3.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（見圖2）。結(jié)果，根據(jù)各對照品溶液出峰時間，確定供試品溶液色譜圖中升麻素苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、迷迭香酸、蒙花苷、甘草酸、木蘭脂素等8個成分的出峰時間分別為26.983、29.989、33.550、35.267、57.846、88.304、113.729、114.648 min，分別表征香菊制劑原方中的防風(fēng)、川芎、黃芪、甘草、夏枯草、野菊花、辛夷[12]。

3.1.5 不同制劑在水中的釋放成分相似度評價 取原方干膏粉6批樣品適量，按“3.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“3.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖并錄入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版）》，生成對照特征圖譜；另取自制香菊顆粒、香菊膠囊、香菊片各3批樣品，同法制備供試品溶液并進樣測定，記錄色譜圖，并與對照特征圖譜進行比較，結(jié)果見圖3。經(jīng)該軟件計算顯示，自制香菊顆粒、香菊膠囊、香菊片與原方干膏粉釋放成分特征圖譜之間的相似度均達0.850以上，各制劑間相似度也均在0.820以上，詳見表2。由此表明，不同香菊制劑特征圖譜相互比較，以及其與對照特征圖譜比較差異均較小，提示不同制劑中所含成分與原方成分較為接近。

圖2 系統(tǒng)適用性特征圖譜Fig 2 System suitability characteristic chromatograms

圖3 不同制劑與原方干膏粉（對照）溶出成分的特征圖譜Fig 3 Characteristic chromatograms of dissolution components from different preparations and original formulation dry extract powder（control）

表2 不同制劑與原方干膏粉溶出成分特征圖譜的相似度Tab 2 Characteristic fingerprint similarity of dissolution components from different preparations and original formulation dry extract powder

3.2 不同香菊制劑與原方干膏粉中黃芪甲苷釋放度比較

以黃芪甲苷水中釋放度為指標(biāo)[16-17]，比較自制香菊顆粒、香菊膠囊、香菊片與原方成分的一致性。

3.2.1 樣品溶液制備 按“3.1.3”項下方法稱取原方干膏粉（批號：YFGGF01）0.6 g和均相當(dāng)于等量干膏粉的自制香菊顆粒（批號：XJKL01）、香菊膠囊（批號：XJJN01）內(nèi)容物、香菊片（批號：XJP01）粉末適量，平行操作6份，精密稱定，加37℃水150 mL，攪拌使分散均勻，過濾；精密移取濾液50 mL，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加水飽和正丁醇萃取3次，每次30 mL；合并正丁醇萃取液，以40%氨水充分洗滌2次，每次40 mL；取上層正丁醇液減壓蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

3.2.2 黃芪甲苷釋放度比較 取“3.2.1”項下樣品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，以外標(biāo)兩點法計算黃芪甲苷含量，并計算釋放度[釋放度＝黃芪甲苷測得質(zhì)量濃度（mg/mL）×水體積150 mL]。結(jié)果顯示，相當(dāng)于0.6 g原方干膏粉的香菊顆粒、香菊膠囊、香菊片樣品中黃芪甲苷平均釋放度分別為0.392、0.358、0.349 mg，詳見表3。采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行單因素方差分析對結(jié)果進行檢驗，方差齊則采用雙側(cè)Dunnett-t檢驗對不同香菊制劑與原方干膏粉測定結(jié)果進行比較。結(jié)果顯示，香菊顆粒中黃芪甲苷的釋放度與原方干膏粉比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而香菊膠囊、香菊片與原方干膏粉之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），詳見表4。

表3 不同制劑與原方干膏粉在水中的黃芪甲苷釋放度（mg）Tab 3 Release rate of astragalosideⅣfrom different preparations and original formulation dry extract powder in water（mg）

表4 不同制劑與原方干膏粉黃芪甲苷釋放度的統(tǒng)計學(xué)檢驗結(jié)果（n＝6）Tab 4 Statistical test results of release rates of astragalosideⅣfrom different preparations and original formulation dry extract powder（n＝6）

4 討論

香菊顆粒具有辛散祛風(fēng)、清熱通竅的作用，常用于緩解和治療急慢性鼻炎、鼻竇炎等[9]。香菊顆粒原質(zhì)控成分黃芪甲苷的含量測定方法為薄層掃描法，但該方法存在重復(fù)性差、空白干擾嚴(yán)重等問題。為修訂、完善其質(zhì)控方法，本課題組采用HPLC法對黃芪甲苷進行測定。由于黃芪甲苷屬于三萜類皂苷，其紫外檢測信號較弱[13]，因此本課題組采用ELSD檢測器進行檢測。ELSD檢測器可彌補紫外檢測器的弱勢檢測區(qū)域，廣泛應(yīng)用于如皂苷類、內(nèi)酯類、糖類及部分生物堿類等成分的定量分析[18]。在前期試驗過程中，本課題組對樣品溶液的制備方法進行了研究，先后對提取方式、提取溶劑等過程進行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純有機溶劑對樣品中黃芪甲苷的溶解效果均不理想，而水飽和正丁醇用于溶解待測成分效果最好。

基于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，本研究從整體化學(xué)特征及有效單一成分兩方面同時評價不同香菊制劑在水中的釋放成分，并與原方干膏粉進行比較。綜合原方中黃酮類、酚酸類及木質(zhì)素類成分，本課題組前期對供試品溶液采用二極管陣列檢測器進行全波長掃描（190～400 nm），結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組分在270 nm波長處均有明顯吸收，因此選擇其作為檢測波長。經(jīng)測定，獲得不同香菊制劑在水中釋放成分的特征圖譜，并標(biāo)定了8個特征峰；相似度分析結(jié)果顯示，不同香菊制劑與原方干膏粉特征圖譜的相似度達到0.850以上，提示其在水中釋放的成分較為接近。進一步對主要有效成分黃芪甲苷的釋放度進行測定和統(tǒng)計學(xué)比較，結(jié)果顯示，香菊顆粒中黃芪甲苷的釋放度與原方干膏粉之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而香菊膠囊、香菊片與原方干膏粉之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上所述，本研究所建立的HPLC-ELSD法準(zhǔn)確、可行，可用于香菊顆粒中黃芪甲苷的含量測定。香菊顆粒與原方干膏粉在水中釋放成分的特征圖譜接近，且主要有效成分黃芪甲苷釋放度基本一致，表明將原方制成香菊顆粒后，制劑中所含成分能夠與原方保持一致；香菊膠囊和香菊片與原方干膏粉在水中釋放成分的特征圖譜相似度也較高，但主要有效成分黃芪甲苷在水中的釋放度存在一定差異。上述結(jié)果提示，中藥復(fù)方不同制劑之間存在一定差異，今后需要通過藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究來佐證中藥復(fù)方不同制劑的治療效果。