正交設(shè)計(jì)優(yōu)化雙斛膠囊中總生物堿的醇提取工藝Δ

陳寬，單冰冰，李婷，田富月，張建永（遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州遵義563000）

酒精性肝損傷（Alcoholic liver disease，ALD）是指酒精性脂肪肝、酒精性肝纖維化、酒精性肝炎以及包括酒精性肝硬化在內(nèi)的因長(zhǎng)期大量飲酒等導(dǎo)致的肝中毒性損傷[1]。目前ALD的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，其治療方法主要包括對(duì)癥用藥和引導(dǎo)患者戒酒等[2]。中醫(yī)認(rèn)為，ALD的治療可從病位和病性兩方面入手，其病位在肝，與膽、脾、胃密切相關(guān)，濕毒、火熱為其主要病性證素[3]。由此可見(jiàn)，ALD的治療應(yīng)注意化濕熱、利小便，以達(dá)到消熱散結(jié)、酒邪內(nèi)解等目的[4]。祁培宏等醫(yī)家根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)的自擬方劑、現(xiàn)有上市的中成藥及單味藥等對(duì)ALD均具有一定的治療效果[5-6]。

石斛藥材來(lái)源于蘭科植物金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）、鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxum Lindl.）或流蘇石斛（Dendrobium fimbriatum Hook.）的栽培品及其同屬植物近似種的新鮮或干燥莖；鐵皮石斛藥材來(lái)源于蘭科植物鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura Migo）的干燥莖[7]。據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》（一部）記載，金釵石斛和鐵皮石斛均具有益胃生津、滋陰清熱之效，可用于治療熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足和陰虛火旺等癥[7]。金釵石斛含有生物堿、聯(lián)芐等成分，主要有效成分為生物堿；鐵皮石斛主要含有多糖、氨基酸等成分，其中多糖為其指標(biāo)性成分[8-9]?，F(xiàn)有研究表明，石斛生物堿可緩解高脂血癥模型大鼠肝臟脂肪變性等癥狀，而石斛多糖在改善酒精導(dǎo)致的肝功能損傷和脂質(zhì)代謝紊亂等方面具有一定作用[10-11]，由此推測(cè)石斛中的這兩類成分有可能發(fā)揮協(xié)同功效。本課題組在石斛的中醫(yī)傳統(tǒng)治療應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究成果，優(yōu)選金釵石斛和鐵皮石斛，以兩種石斛的優(yōu)勢(shì)成分群（即總生物堿和總多糖）作為活性成分，通過(guò)現(xiàn)代提取和制劑技術(shù)，研制出對(duì)亞急性ALD具有緩解和改善作用的雙斛膠囊，該制劑根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中成人日服量規(guī)定[7]，將金釵石斛和鐵皮石斛的用量均設(shè)為4 g（即兩種藥材質(zhì)量比為1∶1）。該制劑的提取工藝主要分為兩個(gè)步驟：首先對(duì)金釵石斛和鐵皮石斛的混合物進(jìn)行醇提以獲得總生物堿部分，將醇提后的藥渣再進(jìn)行水提以獲得總多糖部分。筆者在本文中以干膏得率和總生物堿含量為指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化雙斛膠囊總生物堿的提取工藝，旨在為后期總多糖的提取及雙斛膠囊的深入開發(fā)奠定工藝基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

BT125D型十萬(wàn)分之一電子分析天平[賽多利斯（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司]；FA2004N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；TU-1900型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；AXTGL16M型高速冷凍離心機(jī)（鹽城市安信試驗(yàn)儀器有限公司）；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海上登實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；FW135型中藥材粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；XH-B型旋渦渦旋儀（姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司）。

1.2 藥品與試劑

石斛堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111876-201503，純度：100.0%）；無(wú)水乙醇、鄰苯二甲酸氫鉀（成都金山化學(xué)試劑有限公司）；三氯甲烷、濃鹽酸（重慶川東化工有限公司）；氨水（重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；溴甲酚綠（天津市大茂化學(xué)試劑有限公司）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

金釵石斛（批號(hào)：20170324）、鐵皮石斛（批號(hào)：20170324）由重慶市渝和堂藥業(yè)有限公司提供并進(jìn)行鑒定及檢測(cè)，均產(chǎn)自云南，均符合2015年版《中國(guó)藥典》（一部、四部）“中藥材與飲片”項(xiàng)下石斛和鐵皮石斛的性狀、鑒別及含量測(cè)定有關(guān)規(guī)定，以及“中藥其他方法”項(xiàng)下浸出物測(cè)定、雜質(zhì)檢查、灰分測(cè)定、二氧化硫殘留量測(cè)定的有關(guān)規(guī)定。

2 雙斛膠囊中總生物堿的含量測(cè)定

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 取石斛堿對(duì)照品適量，精密稱定，加三氯甲烷制成20.80μg/mL的對(duì)照品母液；后續(xù)試驗(yàn)取該母液，以三氯甲烷稀釋成相應(yīng)溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉（按質(zhì)量比1∶1混勻，過(guò)30目篩，下同）混合物8 g，置于圓底燒瓶中，以一定量、一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇浸泡后，加熱回流提取數(shù)次（具體參數(shù)見(jiàn)后續(xù)正交試驗(yàn)優(yōu)選工藝）；合并醇提液，放冷，3 500 r/min離心15 min，取上清液，加70%乙醇定容至500 mL，搖勻，于5℃下以3 500 r/min離心15 min；取上清液100 mL，水浴蒸干，殘?jiān)?%稀鹽酸70 mL溶解，搖勻，3 500 r/min離心10 min；取上清液，加濃氨水調(diào)節(jié)pH至10，精密吸取5 mL，用等體積三氯甲烷萃取3次，合并下層，以三氯甲烷稀釋定容至25 mL，搖勻，即得。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

取按“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下方法制備的對(duì)照品溶液（4.16 μg/mL）和供試品溶液，采用酸性染料比色法[12]進(jìn)行顯色反應(yīng)：向?qū)φ掌啡芤夯蚬┰嚻啡芤褐屑尤雙H 4.5的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液5.0 mL和0.04%溴甲酚綠溶液2.0 mL，渦旋3 min萃取，靜置30 min待分層；取下層萃取液5 mL，加入0.01 mol/L氫氧化鈉乙醇溶液1 mL，充分搖勻。采用紫外分光光度計(jì)在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果，兩種溶液均在620 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，故選擇620 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 紫外掃描圖Fig 1 UV scanning spectra

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 顯色穩(wěn)定性考察 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行操作3次。按“2.2”項(xiàng)下酸性染料比色法“加入pH 4.5的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液……充分搖勻”步驟處理完畢后第0、5、10、15、20 min時(shí)測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示，顯色反應(yīng)完畢5 min后吸光度值較不穩(wěn)定，因此供試品溶液需要在顯色反應(yīng)后5 min之內(nèi)測(cè)定。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品母液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分別置于刻度試管中，以三氯甲烷稀釋至10 mL，制成石斛堿質(zhì)量濃度分別為4.16、6.24、8.32、10.40、12.48、14.56 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下酸性染料比色法進(jìn)行顯色反應(yīng)。以三氯甲烷為空白溶劑對(duì)照，采用紫外分光光度計(jì)于620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各樣品溶液的吸光度。以石斛堿質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)，得回歸方程為y＝0.051 4x+0.077（r＝0.999 2）。結(jié)果表明，石斛堿質(zhì)量濃度在4.16～14.56μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行操作3次。供試品溶液在4℃下保存，并分別于3個(gè)不同工作日和每個(gè)工作日第0、4、8、12、24 h時(shí)，按“2.2”項(xiàng)下酸性染料比色法處理后測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算總生物堿含量，分別考察日間與日內(nèi)精密度。結(jié)果，3個(gè)工作日間總生物堿含量的RSD為3.93%（n＝3）；不同工作日當(dāng)天5個(gè)時(shí)間點(diǎn)總生物堿含量的RSD分別為4.52%、2.94%、3.84%（n＝5），表明該方法精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行操作6次。按“2.2”項(xiàng)下酸性染料比色法處理后測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算總生物堿含量。結(jié)果，總生物堿含量的RSD為0.97%（n＝6），表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物4 g，分別加入1.452 6 mg/mL的石斛堿對(duì)照品濃溶液（按“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品母液配制方法新配）1 mL后，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行操作6次。按“2.2”項(xiàng)下酸性染料比色法處理后測(cè)定，并以外標(biāo)法計(jì)算總生物堿含量及加樣回收率。結(jié)果，樣品中總生物堿的平均加樣回收率為93.01%，RSD為1.97%（n＝6），表明該方法準(zhǔn)確度良好，詳見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests（n＝6）

3 雙斛膠囊中總生物堿提取工藝的優(yōu)化

3.1 提取工藝的單因素考察

本研究以綜合評(píng)分法（以干膏得率和總生物堿含量計(jì)算）進(jìn)行單因素考察。取按“2.1.2”項(xiàng)下方法多次加熱回流提取后合并的醇提液的上清液，倒入已在105℃下達(dá)到恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，90℃水浴蒸干，105℃烘箱放置3 h，再轉(zhuǎn)移到干燥器中放冷30 min，稱定質(zhì)量并計(jì)算干膏得率。設(shè)定總生物堿權(quán)重為7分、干膏得率權(quán)重為3分，合計(jì)10分，按公式計(jì)算綜合評(píng)分：綜合評(píng)分＝（總生物堿含量/總生物堿含量最大值）×7+（干膏得率/干膏得率最大值）×3。

3.1.1 浸泡時(shí)間 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、料液比為1∶8、提取時(shí)間為1 h、提取次數(shù)為1次，分別在不浸泡（0 h）和浸泡1、2、12、24 h后加熱回流提取。平行操作3次，依法測(cè)定干膏得率和總生物堿含量，并計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)圖2A。由圖2A可知，在浸泡時(shí)間0～12 h內(nèi)，隨著浸泡時(shí)間的增加，綜合評(píng)分不斷提高；當(dāng)浸泡時(shí)間為12～24 h時(shí)，綜合評(píng)分有所下降；其中以浸泡12 h時(shí)所得綜合評(píng)分最高。因此，本研究選擇浸泡時(shí)間為12 h。

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig 2 Results of single factor tests

3.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù) 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，固定浸泡時(shí)間為12 h、料液比為1∶8、提取時(shí)間為1 h、提取次數(shù)為1次，分別以體積分?jǐn)?shù)為60%、65%、70%、75%、80%、85%的乙醇進(jìn)行回流提取。平行操作3次，依法測(cè)定干膏得率和總生物堿含量，并計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)圖2B。由圖2B可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%～70%時(shí)，綜合評(píng)分較高；其中以乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)，所得綜合評(píng)分最高。因此，本研究選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%～70%進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

3.1.3 料液比 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8g，固定浸泡時(shí)間為12 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%、提取時(shí)間為1 h、提取次數(shù)為1次，分別以料液比1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15（g/mL）回流提取。平行操作3次，依法測(cè)定干膏得率和總生物堿含量，并計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)圖2C。由圖2C可知，當(dāng)料液比為1∶12～1∶13時(shí)，綜合評(píng)分呈迅速增長(zhǎng)的趨勢(shì)；當(dāng)料液比降至1∶13之下時(shí)，綜合評(píng)分有下降的趨勢(shì)。雖然在料液比低于1∶14后綜合評(píng)分又有上升趨勢(shì)，但考慮溶劑量增加會(huì)給后續(xù)濃縮操作帶來(lái)諸多不便，且會(huì)造成試劑浪費(fèi)等，因此綜合以上因素，本研究選擇料液比為1∶12～1∶14進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

3.1.4 提取時(shí)間 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，固定浸泡時(shí)間為12 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%、料液比為1∶13、提取次數(shù)為1次，分別以不提?。? min）和提取28、36、44、52 min進(jìn)行回流提取。平行操作3次，依法測(cè)定干膏得率和總生物堿含量，并計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)圖2D。由圖2D可知，當(dāng)提取時(shí)間為28 min時(shí)，所得綜合評(píng)分已達(dá)最高值?？紤]28 min已經(jīng)是較短時(shí)間，在后期放大研究中可能提取罐還未加熱就已經(jīng)到達(dá)考察的時(shí)間，所以沒(méi)有繼續(xù)對(duì)更短的提取時(shí)間進(jìn)行比較，加之提取36、44 min時(shí)與提取28 min時(shí)所得結(jié)果很接近，因此綜合考慮，本研究選擇提取時(shí)間為28～44 min進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

3.1.5 提取次數(shù) 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，固定浸泡時(shí)間為12 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%、料液比為1∶13、提取時(shí)間為28 min，分別回流提取1、2、3、4次。平行操作3次，依法測(cè)定干膏得率和總生物堿含量，并計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)圖2E。由圖2E可知，隨著提取次數(shù)的增加（1～3次），綜合評(píng)分也相應(yīng)升高；當(dāng)提取第4次時(shí)，綜合評(píng)分下降，推測(cè)可能是長(zhǎng)時(shí)間蒸發(fā)溶劑導(dǎo)致總生物堿成分受到破壞。因此，本研究選擇提取次數(shù)為1～3次進(jìn)行正交試驗(yàn)考察。

3.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

3.2.1 正交試驗(yàn)考察 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）為影響因素，以干膏得率和總生物堿含量的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行醇提取工藝的L9（34）正交試驗(yàn)，平行操作3次。因素和水平見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 因素和水平Tab 2 Factors and levels

由表3可知，各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響大小依次為D＞B＞C＞A，最優(yōu)方案為A3B3C1D3。由表4可知，除D因素對(duì)工藝的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余因素的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合考慮提取效率和節(jié)約能源等因素，結(jié)合單因素考察結(jié)果，最終將醇提取工藝的最優(yōu)提取條件確定為A3B1C1D3，即浸泡12 h后，按乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶12（g/mL）提取28 min，共提取3次。

3.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，混勻，按“3.2.1”項(xiàng)下最優(yōu)醇提取工藝條件進(jìn)行提取并計(jì)算干膏得率和總生物堿含量，平行操作3次。結(jié)果，干膏平均得率為12.80%（RSD＝4.39%，n＝3），總生物堿平均含量為0.359 0 mg/g（RSD＝0.66%，n＝3），表明優(yōu)化工藝條件穩(wěn)定、可行。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Tab 3 Design and results of orthogonal tests

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Results of variance analysis

4 討論

本研究采用經(jīng)典的酸性染料比色法測(cè)定總生物堿的含量，其原理為在適當(dāng)?shù)膒H條件下生物堿與氯離子結(jié)合生成陰離子，而陰離子與酸性染料中的陽(yáng)離子定量結(jié)合成離子對(duì)，在一定波長(zhǎng)處測(cè)定離子對(duì)的吸光度可用于間接反映生物堿含量[13]。由此可見(jiàn)，緩沖液的pH值和用量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要[14]。本研究參考文獻(xiàn)方法[15-17]，采用溴甲酚綠為酸性染料，以pH 4.5的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液5 mL調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值，然后在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定產(chǎn)物離子對(duì)的吸光度；同時(shí)對(duì)顯色穩(wěn)定性進(jìn)行考察，結(jié)果表明供試品溶液需要在顯色反應(yīng)后5 min之內(nèi)測(cè)定，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，本研究所建方法簡(jiǎn)便可行、靈敏度高，可用于雙斛膠囊提取物中總生物堿的含量測(cè)定。

生物堿是最早從石斛屬中分離得到的化學(xué)成分，其中金釵石斛已被證實(shí)為含有生物堿的種類最多、含量最高的品種，另外也有文獻(xiàn)報(bào)道鐵皮石斛中存在生物堿[8-9]。大量研究報(bào)道已經(jīng)證實(shí)，石斛生物堿類具有較強(qiáng)的藥理活性[18-21]。目前總生物堿的提取方法較多，主要包括采用有機(jī)溶劑加熱回流提取、酶法反應(yīng)、超聲提取、微波萃取等[22-24]?？紤]到石斛藥材價(jià)格較高需避免浪費(fèi)，而提取工藝越簡(jiǎn)單則越易藥材損耗且成本較低，故本研究采用有機(jī)溶劑加熱回流提取，提取完成后可回收溶劑從而減少試劑損耗。甲醇和乙醇作為生物堿提取中最常見(jiàn)的有機(jī)溶劑，價(jià)廉易得，但甲醇毒性較大，故選擇乙醇作為總生物堿的提取溶劑[25]。

本課題組針對(duì)雙斛膠囊醇提取工藝進(jìn)行研究，通過(guò)單因素試驗(yàn)，初步確定浸泡時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)干膏得率和總生物堿含量的影響。前期實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，外界環(huán)境如天氣變化導(dǎo)致的溫濕度差異等對(duì)提取效果有一定干擾，因此為在較短的時(shí)間內(nèi)完成正交試驗(yàn)考察，將浸泡時(shí)間固定為12 h，以減少環(huán)境變化的干擾，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確可靠。在單因素考察的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為因素進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)篩選。結(jié)果顯示，各考察因素對(duì)綜合評(píng)分的影響強(qiáng)弱順序?yàn)樘崛〈螖?shù)＞提取時(shí)間＞料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)；各因素中以提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分的影響最大，且僅該因素的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜合考慮因素顯著性以及時(shí)間、成本等，最終確定雙斛膠囊總生物堿的最佳醇提取工藝條件為固定浸泡12 h后，按乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1∶12（g/mL）提取28 min，共提取3次；驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定、可行。本研究可為雙斛膠囊的下一步開發(fā)奠定良好的工藝基礎(chǔ)。