二氮嗪對(duì)氧化損傷狀態(tài)下軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響機(jī)制研究Δ

蔣翠云，任少琳，張純萍，程少文（.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，?？?7002；2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)中心，?？?57002）

關(guān)節(jié)軟骨是保障關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)的最主要結(jié)構(gòu)，軟骨細(xì)胞位于軟骨組織表層，可隨著關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境的變化而相應(yīng)地合成和分泌基質(zhì)與纖維[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，在關(guān)節(jié)軟骨退變的過程中，軟骨細(xì)胞的增殖活力減弱、凋亡增多[2]。軟骨細(xì)胞的凋亡途徑主要包括線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）途徑等[3]。有研究證實(shí)，抑制ERS途徑可減少軟骨基質(zhì)中聚蛋白多糖酶和Ⅱ型膠原蛋白（Coll-Ⅱ）的表達(dá)，使軟骨細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)、凋亡減少[4]。因此，抑制ERS途徑可使軟骨細(xì)胞恢復(fù)正常的增殖和凋亡狀態(tài)，保護(hù)軟骨細(xì)胞，減少關(guān)節(jié)軟骨缺失，對(duì)防治骨關(guān)節(jié)炎（OA）等關(guān)節(jié)軟骨退行性疾病有重要意義。二氮嗪是一種鉀離子通道激活劑，具有松弛血管平滑肌、降低血壓、抑制胰島素分泌的作用，臨床上主要用于高血壓危象急救及低血糖癥等的治療[5]。有研究表明，二氮嗪可通過抑制ERS途徑來促進(jìn)骨骼肌成肌細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡[6]。但目前尚未見二氮嗪對(duì)氧化損傷狀態(tài)下軟骨細(xì)胞增殖活力及凋亡的影響機(jī)制研究。因此，本研究從ERS途徑探討二氮嗪對(duì)氧化損傷狀態(tài)下軟骨細(xì)胞增殖活力及凋亡影響的作用機(jī)制，旨在為該藥防治關(guān)節(jié)軟骨退行性病變的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BSA124S/BSA124S-CW型分析天平（蘇州金鉆稱重設(shè)備系統(tǒng)開發(fā)有限公司）；64R型低溫高速離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；FYL-YS-50L型恒溫培養(yǎng)箱（美國Godinier公司）；ELx800NB型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；Attune NxT型流式細(xì)胞儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DYCZ-24F型電泳儀（紹興上虞艾科儀器設(shè)備有限公司）；ChemiDocXRS+型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

二氮嗪（批號(hào)：022K1516，純度：98%）、30%過氧化氫（H2O2）溶液均購自美國Sigma公司；胰酶（濟(jì)南維爾康生化制藥有限公司）；Ⅱ型膠原酶（美國Worthington公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；CCK-8檢測試劑盒（上海銳賽生物技術(shù)有限公司）；Bin-ding buffer溶液（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）；AnnexinⅤ-PE細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海繼錦化學(xué)科技有限公司）；BCA蛋白定量檢測試劑盒（武漢華瑞康生物科技有限公司）；細(xì)胞裂解液（北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司）；兔抗人胱天蛋白酶3（Caspase-3）單克隆抗體（上海滬宇生物科技有限公司）；兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）單克隆抗體（上海麥倉生物醫(yī)藥科技有限公司）；兔抗人增強(qiáng)子結(jié)合蛋白環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（CHOP）單克隆抗體（上海美恩生物技術(shù)有限公司）；兔抗人甘油三磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（武漢艾美捷科技有限公司）；過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（杭州昊鑫生物科技股份有限公司）；ECL電化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海炎熙生物科技有限公司）；pH 7.5磷酸鹽緩沖液（PBS，上海田源生物技術(shù)有限公司）；其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD小鼠3只，雌性，1周齡，體質(zhì)量為（20±2）g，購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006。

2 方法

2.1 小鼠軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

取3只小鼠，對(duì)其膝關(guān)節(jié)作無菌處理后摘取膝關(guān)節(jié)軟骨，用眼科剪剪成絮狀，PBS沖洗，胰酶消化0.5 h，Ⅱ型膠原酶消化2 h。取上清液，以2 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，加入DMEM培養(yǎng)基10 mL重懸細(xì)胞后，按1×106個(gè)/皿接種于培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2恒溫箱內(nèi)孵育，每72 h換液1次，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)95%以上時(shí)進(jìn)行消化、傳代，取第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 分組與給藥

參考文獻(xiàn)[6]的給藥劑量和作用時(shí)間進(jìn)行分組、給藥。取第3代軟骨細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、損傷模型組和二氮嗪組，按1×106個(gè)/cm2的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。對(duì)照組細(xì)胞不作處理；損傷模型組細(xì)胞加入300 μmol/L的H2O2溶液100 μL后，在37 ℃、5%CO2恒溫箱內(nèi)孵育8 h；二氮嗪組細(xì)胞加入300 μmol/L的二氮嗪溶液（以0.4%二甲基亞砜溶液為溶劑配制）100 μL，在37℃、5%CO2恒溫箱內(nèi)孵育0.5 h進(jìn)行預(yù)處理后，再加入300 μmol/L H2O2溶液100 μL，與損傷模型組同法孵育8 h。

2.3 軟骨細(xì)胞增殖活力檢測

采用CCK-8法檢測。取第3代軟骨細(xì)胞，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、給藥并孵育完畢后，吸棄上清液，每孔加入10%CCK-8溶液100 μL，于37 ℃、5%CO2恒溫箱孵育4 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長下測定光密度（OD值）。試驗(yàn)重復(fù)3次后取均值。按公式計(jì)算細(xì)胞增殖活力：細(xì)胞增殖活力＝（損傷模型組或二氮嗪組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%。

2.4 軟骨細(xì)胞凋亡率檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測。取第3代軟骨細(xì)胞，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、給藥并孵育完畢后，以2 000 r/min離心5 min，棄上清，胰酶消化細(xì)胞。收集貼壁軟骨細(xì)胞，加入Binding buffer溶液500 μL重懸細(xì)胞，然后加入Annexin V-PE試劑1 μL，混勻，于25℃下避光反應(yīng)10 min，在1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。試驗(yàn)重復(fù)3次后取均值。

2.5 軟骨細(xì)胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表達(dá)量檢測

采用Western blotting法檢測。取第3代軟骨細(xì)胞，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、給藥并孵育完畢后，加細(xì)胞裂解液，勻漿，12 000 r/min離心8 min；取上清液，以BCA試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白上樣，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜；將膜在5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，分別加入Caspase-3單克隆抗體（1∶200）、Bax單克隆抗體（1∶100）、CHOP單克隆抗體（1∶300）后，均與內(nèi)參GAPDH單克隆抗體（1∶100）混合，4℃下孵育過夜；PBS沖洗膜，加入二抗（1∶500），37℃孵育1 h；PBS沖洗，ECL顯色、顯影。采用凝膠成像儀掃描，以Image Quant TL軟件分析各目標(biāo)蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值之比（即相對(duì)灰度值），用來表示目標(biāo)蛋白表達(dá)量。試驗(yàn)重復(fù)3次后取均值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組軟骨細(xì)胞增殖活力比較

與對(duì)照組比較，損傷模型組軟骨細(xì)胞增殖活力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與損傷模型組比較，二氮嗪組軟骨細(xì)胞增殖活力顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 各組軟骨細(xì)胞的增殖活力和凋亡率（±s，n＝3）Tab 1 Proliferation activity and apoptotic rate of chondrocyte in each group（±s，n＝3）

表1 各組軟骨細(xì)胞的增殖活力和凋亡率（±s，n＝3）Tab 1 Proliferation activity and apoptotic rate of chondrocyte in each group（±s，n＝3）

注：與對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與損傷模型組比較，#P＜0.05Note：vs.control group，＊P＜0.05；vs.injury model group，#P＜0.05

凋亡率，%32.45±1.67 75.68±2.05＊46.59±2.25#組別對(duì)照組損傷模型組二氮嗪組增殖活力，%100.00±0.00 41.29±3.02＊67.35±2.68#

3.2 各組軟骨細(xì)胞凋亡率比較

與對(duì)照組比較，損傷模型組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與損傷模型組比較，二氮嗪組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見圖1、表1。

圖1 各組軟骨細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞圖Fig 1 Flow cytograms of apoptotic rate of chondrocyte in each group

3.3 各組軟骨細(xì)胞中Caspase-3、Bax、CHOP的蛋白表達(dá)量比較

與對(duì)照組比較，損傷模型組軟骨細(xì)胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與損傷模型組比較，二氮嗪組軟骨細(xì)胞中上述蛋白表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見圖2、表2。

圖2 各組軟骨細(xì)胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表達(dá)電泳圖Fig 2 Electrophoretograms of protein expression of Caspase-3，Bax and CHOP in chondrocyte in each group

表2 各組軟骨細(xì)胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表達(dá)量（±s，n＝3）Tab 2 Protein expression of Caspase-3，Bax and CHOP in chondrocyte in each group（±s，n＝3）

表2 各組軟骨細(xì)胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表達(dá)量（±s，n＝3）Tab 2 Protein expression of Caspase-3，Bax and CHOP in chondrocyte in each group（±s，n＝3）

注：與對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與損傷模型組比較，#P＜0.05Note：vs.control group，＊P＜0.05；vs.injury model group，#P＜0.05

組別對(duì)照組損傷模型組二氮嗪組CHOP 1.04±0.02 2.62±0.22＊1.73±0.18#Caspase-3 1.03±0.03 2.41±0.23＊1.50±0.16#Bax 1.05±0.02 1.82±0.19＊1.44±0.09#

4 討論

OA是以關(guān)節(jié)基質(zhì)破壞及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞減少為主要病理特點(diǎn)的退行性關(guān)節(jié)疾病，而關(guān)節(jié)軟骨是由致密結(jié)締組織的膠原纖維構(gòu)成的透明軟骨，軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中的唯一細(xì)胞成分，存在于無血管、神經(jīng)或淋巴管分布的特殊微環(huán)境中，其既能合成蛋白多糖、Coll-Ⅱ等基質(zhì)大分子物質(zhì)，又能降解衰老退變的軟骨基質(zhì)，還參與維持軟骨組織平衡[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞發(fā)生氧化損傷后較正常軟骨細(xì)胞在體外的增殖活力明顯減弱、凋亡明顯增多[8]。有研究顯示，H2O2可誘導(dǎo)骨骼肌成肌細(xì)胞凋亡，可作為氧化損傷造模試劑[9]。本研究通過H2O2誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生氧化損傷后發(fā)現(xiàn)，在氧化損傷狀態(tài)下的軟骨細(xì)胞增殖活力顯著下降，凋亡率顯著升高。

軟骨細(xì)胞大量凋亡主要表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體的增加以及自噬性空泡形成[10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種具有分泌功能的細(xì)胞器，也是蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要場所，在ERS過程中發(fā)揮著重要作用[11]。ERS包括缺糖損傷、未折疊蛋白增加、鈣離子流失及自由基釋放過多等，這些刺激因素均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)鈣離子平衡紊亂、未折疊蛋白聚集等，進(jìn)而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)，使細(xì)胞增殖活性減弱、凋亡增強(qiáng)，造成關(guān)節(jié)軟骨大量缺失，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退行性病變[12]。Caspase-3、Bax、CHOP為ERS途徑相關(guān)蛋白。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵分子，在某些細(xì)胞凋亡末期的細(xì)胞裂解及凋亡小體形成過程中扮演重要角色，可激活下游的細(xì)胞凋亡蛋白酶[13]。Bax是重要的促細(xì)胞凋亡基因之一，其編碼產(chǎn)物可通過與B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）家族中的凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合，替換Bcl-xL/Bax、Bcl-2/Bax二聚體中的Bax，而達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的目的[14]。CHOP基因受蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶等通路調(diào)控，是ERS誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的重要因素[15]。本研究通過Western blotting法檢測發(fā)現(xiàn)，損傷模型組軟骨細(xì)胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組顯著升高，表明軟骨細(xì)胞發(fā)生氧化損傷后其ERS作用增強(qiáng)，導(dǎo)致上述蛋白表達(dá)上調(diào)。

有研究顯示，二氮嗪可通過抑制死亡受體和線粒體途徑改善抗谷氨酸鹽、β-淀粉樣蛋白等誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷[16-17]；其可通過阻礙ERS途徑抑制H2O2誘導(dǎo)的骨骼肌成肌細(xì)胞凋亡[5]。本研究結(jié)果顯示，二氮嗪組軟骨細(xì)胞增殖活力較損傷模型組顯著升高，凋亡率則顯著降低，表明二氮嗪可有效抑制氧化損傷誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，提高軟骨細(xì)胞增殖活力。Western blotting檢測結(jié)果顯示，二氮嗪組軟骨細(xì)胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表達(dá)量均較損傷模型組顯著降低，提示二氮嗪可通過下調(diào)軟骨細(xì)胞中的上述蛋白來抑制ERS，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，避免氧化損傷誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活力下降及過度凋亡，從而預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨退行性病變的發(fā)生。這與已有研究結(jié)果相符。

綜上所述，二氮嗪可能通過抑制ERS途徑，提高軟骨細(xì)胞在氧化損傷狀態(tài)下的增殖活力，并抑制軟骨細(xì)胞凋亡，這可為防治關(guān)節(jié)軟骨退行性病變提供新的治療思路與方向，具有重要的臨床意義。但二氮嗪是否通過其他機(jī)制對(duì)氧化損傷狀態(tài)下的軟骨細(xì)胞的增殖及凋亡產(chǎn)生影響尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。