椎旁注射臭氧對SD大鼠盤源性疼痛模型的鎮(zhèn)痛作用

吳志強(qiáng)，周利君，陳 嵩，李健齊，周志勇，莊文權(quán)

（中山大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院放射介入科；

2.疼痛研究中心，廣東廣州510080）

經(jīng)皮穿刺纖維化臭氧注射術(shù)治療腰椎間盤突出癥引起的疼痛是一種安全有效的治療方法。然而Kang等［1］在總結(jié)大量臨床實踐發(fā)現(xiàn)，該方法并不能緩解患者椎間盤退變情況，反而可能加劇其退變。動物實驗也發(fā)現(xiàn)，穿刺椎間盤的有創(chuàng)操作可加速其退變［2］。此后，一項多中心隨機(jī)對照研究證實，在椎旁肌肉注射臭氧也同樣能緩解腰椎間盤突出癥患者的疼痛［3］。這或許可以減少對椎間盤的損傷從而緩解其退變。De Oliveira Magalhaes等［4-5］在多項薈萃分析認(rèn)為椎旁注射臭氧減少了椎間盤的再次損傷，可達(dá)到鎮(zhèn)痛作用，且并發(fā)癥發(fā)生率下降，逐漸被臨床醫(yī)師接受。然而椎旁注射臭氧的鎮(zhèn)痛規(guī)律，以及其對椎間盤退變的影響尚不明確。Murphy等［6］驗證了臭氧可以減輕神經(jīng)根受壓達(dá)到鎮(zhèn)痛作用，并認(rèn)為抗炎作用是臭氧鎮(zhèn)痛的另一機(jī)制但未得到證實。同時臭氧椎旁注射是否會加重椎間盤退變尚不明確。為了更好地指導(dǎo)今后的臨床工作，本實驗首先使用行為學(xué)方法研究臭氧椎旁注射對SD大鼠盤源性疼痛模型的鎮(zhèn)痛規(guī)律，再通過磁共振掃描研究椎間盤退變的規(guī)律，最后通過western blot檢測臭氧對坐骨神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）和降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin related gene peptide，CGRP）的影響，初步探討其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取鼠齡約7周的SPF級SD雄性大鼠65只，體質(zhì)量220～250 g，由中山大學(xué)實驗動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)和使用許可證分別為：SCXK（粵）2016-0029和SYXK（粵）2017-0081。飼養(yǎng)環(huán)境為恒溫（22±2）℃，恒濕（55±5）%，每天照明12 h。大鼠入組條件：①雙后肢50%機(jī)械撤足閾值（50%mechanical withdrawal threshold，50%MWT）均高于10 g。②MR-T2WI成像各腰椎間盤Pfirrmann分級［7］均為I級，無先天性椎骨融合，無脊髓和坐骨神經(jīng)受壓表現(xiàn)。本動物實驗經(jīng)中山大學(xué)實驗動物管理與使用委員會批準(zhǔn)，并根據(jù)中山大學(xué)動物實驗中心的實驗動物操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 實驗試劑和儀器

VonFrey纖毛儀購自Stoelting公司，數(shù)字減影血管造影機(jī)（Allura Xper FD20）購自PHILIPS公司，磁共振掃描儀（Achieva 1.5T A-Series Nova Dual）購自PHILIPS公司，腫瘤壞死因子α一抗（ab8348）、降鈣素基因相關(guān)肽一抗（ab47027）、βactin一抗（ab8226）購自Abcam公司。

1.3 動物分組

采用隨機(jī)數(shù)表法分組，隨機(jī)入選15只SD大鼠為對照組（50%MWT＞10 g）。另將成功建立的SD大鼠盤源性疼痛模型（50%MWT＜2 g）50只隨機(jī)分為模型組（n=25）和臭氧組（n=25）。對照組不做任何處理，模型組經(jīng)皮穿刺L5-6纖維環(huán)建立盤源性疼痛模型，臭氧組在造模成功后第22天椎旁注射25 mg/L臭氧1 mL。三組大鼠均在造模前1天，造模后第1、3、7、14和21天，臭氧干預(yù)后第1、3、5、7、14、21、28和35天分別測量雙后足50%MWT。臭氧干預(yù)后第8天取左側(cè)坐骨神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)，檢測相關(guān)組織中TNF-α、CGRP的相對表達(dá)濃度。模型組在造模前1 d，造模后第14、21、28、35天行磁共振T2WI掃描。臭氧組在造模前1 d，造模后第14、21、35天及臭氧干預(yù)后第7、14天行磁共振T2WI掃描。

1.4 SD大鼠椎間盤源性疼痛模型的建立及臭氧干預(yù)處理

SD大鼠椎間盤源性疼痛模型的建立詳細(xì)步驟見文獻(xiàn)［2］。臭氧組的處理：在模型成功建立后22 d，將臭氧組SD大鼠用100 g/L水合氯醛（3.5 mL/100 g）腹腔注射麻醉，術(shù)野皮膚備皮后俯臥在硬紙板上并固定其四肢、消毒術(shù)野皮膚。在數(shù)字減影血管造影機(jī)透視引導(dǎo)下定位L5-6椎間盤，用27G注射針頭從脊柱左側(cè)旁處入路穿刺至L5-6椎間盤的椎旁近坐骨神經(jīng)出口處，針與水平面夾角約45°。穿刺過程中注意大鼠左下肢是否顫動（若穿刺針刺激到坐骨神經(jīng)，大鼠則會出現(xiàn)左下肢不自主顫動）。正側(cè)位觀察穿刺針位置和方向，針尖位置準(zhǔn)確后，緩慢注射25 mg/L臭氧1 mL（圖1）。注射完針頭停留30 s后拔針。模型組造模成功后不做干預(yù)，對照組為正常SD大鼠。

圖1 臭氧椎旁注射X線片正側(cè)位及操作示意圖Fig.1 X-ray and illustration of paravertebral ozone injection

1.5 SD大鼠行為學(xué)觀察

造模前1 d，造模后第1、3、7、14、21天以及臭氧干預(yù)后第1、3、5、7、14、21、28和35天將各組大鼠放置于有機(jī)玻璃箱內(nèi)，觀察大鼠有無易激惹、撕咬肢體、運動功能障礙以及有無大小便失禁等情況。

1.6 SD大鼠50%MWT的測定

造模前1 d，造模后第1、3、7、14、21天以及臭氧干預(yù)后第1、3、5、7、14、21、28和35天將各組大鼠放置于有機(jī)玻璃箱內(nèi)，參考Garraway的“Up-Down”方法［8］測定50%MWT。

1.7 磁共振T2WI序列檢查

磁共振檢查建模前后及臭氧干預(yù)前后椎間盤退變情況：模型組大鼠隨機(jī)取20只在建模前1 d，建模后第14、21、28、35天分別行腰椎間盤磁共振T2WI序列檢查。臭氧組大鼠隨機(jī)取20只在建模前1 d，建模后第14、21天，臭氧干預(yù)后第7、14天分別行腰椎間盤磁共振T2WI序列檢查。觀察大鼠L4-5，L5-6，L6-7椎間盤退變情況。由磁共振室2名教授采用Pfirrmann分級法進(jìn)行盲法分級［7］。

1.8 腫瘤壞死因子α、降鈣素基因相關(guān)肽的檢測

臭氧干預(yù)后第7天，對照組、模型組和臭氧組各取5只大鼠，麻醉，在冰面上取材，取左側(cè)坐骨神經(jīng)（出髂骨段至分出腓總神經(jīng)以上部分）、左側(cè)L4-6背根神經(jīng)節(jié)，標(biāo)本取出后立即放液氮中極速冷凍。按照Wu等［2］的Western blot方法測定組織中的腫瘤壞死因子α和降鈣素基因相關(guān)肽。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。50%MWT結(jié)果采用重復(fù)測量方差分析，方差不齊時，使用Greenhouse-Geisser方法進(jìn)行校正。若存在交互效應(yīng)，進(jìn)一步采用多元方差分析方法檢驗組別和時間的單獨效應(yīng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義時均采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較。L5-6椎間盤Pfirrmann分級采用卡方檢驗分析。Western blot結(jié)果采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義時均采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較。雙側(cè)檢驗，以α=0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠一般行為學(xué)檢測結(jié)果

成模及臭氧干預(yù)后，所有SD大鼠均未出現(xiàn)易激惹、撕咬肢體、運動功能障礙以及尿便失禁等情況。

2.2 SD大鼠50%MWT檢測結(jié)果及療效分析

造模前3組50%MWT差異無統(tǒng)計學(xué)意義（左n=50，F(xiàn)=0.037，P=0.964；右n=50，F(xiàn)=1.11，P=0.338）。造模后第1天，模型組和臭氧組50%MWT均有下降，模型組或臭氧組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001）；而模型組與臭氧組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（左P=0.258，右P=0.832）；造模后第3～21天，對照組與模型組或臭氧組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001）。而模型組與臭氧組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（左P=0.583，右P=0.343）。造模后第22天給予25 mg/L臭氧干預(yù)。造模后第22天，3組50%MWT兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001）。在臭氧干預(yù)前后各時間點，模型組組內(nèi)50%MWT無統(tǒng)計學(xué)差異（左P=0.985，右P=0.973）。臭氧組50%MWT從造模后第22天開始上升（左后足7.6±6.8，右后足3.6±1.0），至造模后第24天達(dá)到最高峰（左后足10.6±8.2，右后足7.9±6.7），以后維持這一水平至造模后第56天（圖2）。

圖2 三組SD大鼠的雙后足50%MWT的變化曲線Fig.2 Curve of 50%mechanical withdrawal threshold of both hind paws in three groups

模型組和臭氧組SD大鼠在造模后雙后足50%MWT均低于2.0 g。臭氧組SD大鼠共20只，50%（10/20）大鼠左后足疼痛在造模后第22天開始緩解（50%MWT＞4.0 g）；大鼠左后足疼痛在造模后第28天的緩解率為90%（50%MWT＞ 4.0 g），其中40%大鼠疼痛基本緩解（50%MWT＞10.0 g）。40%大鼠右后足疼痛在造模后第22天開始緩解（50%MWT＞4.0 g），大鼠右后足疼痛在造模后第28天的緩解率為70%（50%MWT＞4.0 g），其中20%的大鼠右后足疼痛基本緩解（50%MWT＞10.0 g）。模型組的SD大鼠在隨訪期間雙后足50%MWT沒有改善。

2.3 模型組和臭氧組大鼠腰椎間盤磁共振T2WI序列掃描結(jié)果

模型組大鼠建模后各時間點L5-6椎間盤Pfirrmann分級有統(tǒng)計學(xué)差異，隨時間延長而Pfirrmann分級更高（n=40，H=13.88，P ＜ 0.001）。臭氧組大鼠在臭氧干預(yù)后Pfirrmann分級高于模型組大鼠（n=40，H=9.38，P ＜ 0.001；圖3，表1）。

圖3 模型組和臭氧組大鼠腰椎間盤磁共振T2WI成像信號變化Fig.3 Sagittal MR T2weighted images of rat intervertebral disk before and after modeling and ozone injection

表1 模型組和臭氧組大鼠腰椎間盤磁共振Pffirmann分級Table 1 Pffirmann grade of L5-6 intervertebral disk in model group and ozone group

2.4 腫瘤壞死因子α和降鈣素相關(guān)基因肽表達(dá)結(jié)果

3組SD大鼠，左側(cè)坐骨神經(jīng)中腫瘤壞死因子α（n=15，F(xiàn)=13.28，P ＜ 0.001）和降鈣素基因相關(guān)肽（n=15，F(xiàn)=9.32，P ＜ 0.001）在3組表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩兩比較發(fā)現(xiàn)模型組的表達(dá)均高于臭氧組，臭氧組又高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001；圖4）。

圖4 三組SD大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)中腫瘤壞死因子-α和降鈣素基因相關(guān)肽的表達(dá)情況Fig.4 Expression of calcitonin gene-related peptide and tumor necrosis factor-α in sciatic nerve in three groups

2.5 三組SD大鼠左側(cè)背根神經(jīng)節(jié)中腫瘤壞死因子和降鈣素相關(guān)基因肽的表達(dá)結(jié)果

左側(cè)背根神經(jīng)節(jié)中腫瘤壞死因子α（n=15，F(xiàn)=11.98，P＜0.001）和降鈣素基因相關(guān)肽（n=15，F(xiàn)=12.86，P＜0.001）在3組表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩兩比較發(fā)現(xiàn)模型組的表達(dá)均高于臭氧組，臭氧組又高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001；圖5）。

圖5 三組SD大鼠左側(cè)背根神經(jīng)節(jié)中腫瘤壞死因子-α和降鈣素基因相關(guān)肽的表達(dá)Fig.5 Expression of calcitonin gene-related peptide and tumor necrosis factor-α in dorsal root ganglion in three groups

3 討論

背根神經(jīng)節(jié)不僅參與了痛覺的傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)的外周機(jī)制，同時作為感覺傳入的初級神經(jīng)中樞，具有合成和分泌功能［9］。Krames等［10］發(fā)現(xiàn)，纖維環(huán)損壞時所釋放的物質(zhì)可刺激背根神經(jīng)節(jié)開發(fā)離子通道，通過坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)，引起下肢痛覺敏感。背根神經(jīng)損傷所致的痛覺過敏、痛覺異常和自發(fā)的持續(xù)性疼痛都是由初級傳入神經(jīng)元的變化所引起。這些癥狀至少部分反映了初級傳入神經(jīng)元電活性和/或表型的變化。尤其是初級傳入神經(jīng)元異位電活動，不僅是持續(xù)的臨床神經(jīng)病理性疼痛癥狀的點火者，同時還參加了痛覺過敏和痛覺異常密切相關(guān)的中樞敏化［11］。

Niu等［12］研究發(fā)現(xiàn)，臭氧濃度的選擇與療效密切相關(guān)，過低濃度可能因氧化作用弱使療效欠佳，而過高濃度則容易引起組織損傷。臨床上治療腰椎間盤突出癥的濃度為25～50 mg/L，注射劑量在5～15 mL。本研究在前期預(yù)實驗中也發(fā)現(xiàn)25 mg/L濃度的臭氧1 mL椎旁注射對SD大鼠盤源性疼痛模型已有較好的鎮(zhèn)痛作用，而更大劑量（2 mL）容易導(dǎo)致實驗動物死亡。根據(jù)術(shù)中X線透視下所見及動物尸體解剖發(fā)現(xiàn)：部分大鼠在臭氧注射時有明顯沿椎管上行至腦部的氣流，數(shù)秒后實驗動物即出現(xiàn)呼吸驟停，解剖未發(fā)現(xiàn)大鼠脊髓損傷。實驗動物的死亡原因考慮與臭氧通過椎管擴(kuò)散至高級神經(jīng)中樞，抑制呼吸中樞有關(guān)。本實驗最后選擇濃度25 mg/L臭氧1 mL椎旁注射作為研究干預(yù)條件。

本研究通過檢測SD大鼠盤源性疼痛模型的臭氧干預(yù)前后的雙后足50%MWT的變化，初步結(jié)果顯示大鼠盤源性疼痛模型椎旁注射25 mg/L臭氧1 mL后，90%的大鼠左后足50%MWT明顯升高（由1.31±0.52提高至4.24±1.96），顯示有鎮(zhèn)痛效果，有40%的大鼠疼痛癥狀基本消失，由此可以推斷椎旁注射25 mg/L臭氧1 mL對大鼠盤源性疼痛模型有一定的鎮(zhèn)痛作用。

本研究對比了模型組大鼠與臭氧組大鼠椎間盤T2WI表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)臭氧椎旁注射雖能緩解椎間盤退變引起的疼痛，但卻加速了椎間盤的退變，是一種破壞性的治療方式，故在臨床實踐中，對于盤源性疼痛的早期患者，可以通過一些非干預(yù)性的治療緩解癥狀，而臭氧椎旁注射并不是一種首選方法。

正常情況下腫瘤壞死因子α在中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)很低，分布亦較局限。脊髓損傷時，腫瘤壞死因子α的表達(dá)上調(diào)，主要分布于神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞［13］。Shubayev等［14］將示蹤的腫瘤壞死因子α注射到大鼠的坐骨神經(jīng)損傷部位后，發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α可以由軸突逆行轉(zhuǎn)運至脊神經(jīng)節(jié)；又在大鼠的L5神經(jīng)節(jié)注射生物素化的腫瘤壞死因子α，應(yīng)用抗生物素化的方法測定其移動的位置，發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α可以傳導(dǎo)至正常和受傷的大鼠外周神經(jīng)，也可以傳至損傷側(cè)的脊髓后角。他們認(rèn)為外周神經(jīng)損傷后腫瘤壞死因子α逆行傳至中樞，可能參與了中樞部位的細(xì)胞因子的激活，是神經(jīng)源性疼痛發(fā)病機(jī)制原因之一。在本實驗研究中我們發(fā)現(xiàn)，臭氧干預(yù)后SD大鼠坐骨神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)的腫瘤壞死因子α有明顯下降，但并未降至造模前水平，而大鼠左后足50%MWT也同時表現(xiàn)為較治療前明顯升高而未完全達(dá)到造模前水平。臭氧組50%MWT顯著高于模型組。這與Murphy等［6］研究結(jié)果類似。可能原因是臭氧治療可以緩解但不能完全阻止大鼠盤源性疼痛的炎癥性反應(yīng)。當(dāng)再次出現(xiàn)外界刺激時，炎癥細(xì)胞可能再次被激活，并釋放炎癥因子引起疼痛復(fù)發(fā)。在臨床上我們也發(fā)現(xiàn)，部分患者在臭氧治療一段時間后可出現(xiàn)疼痛癥狀復(fù)發(fā)，再次接受臭氧治療后疼痛癥狀仍可緩解或消失。

越來越多的證據(jù)表明，降鈣素基因相關(guān)肽在外周致敏和相關(guān)的增強(qiáng)疼痛的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。降鈣素基因相關(guān)肽參與神經(jīng)源性炎癥的發(fā)展，并且在炎癥和神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生時上調(diào)［15］。降鈣素基因相關(guān)肽主要介導(dǎo)傷害性感受傳遞，并在外周敏化和中樞敏化中均起到重要作用［16］。De Logu等［17］發(fā)現(xiàn)：大量的興奮性離子通道和受體可以誘導(dǎo)降鈣素基因相關(guān)肽的釋放，從而誘發(fā)疼痛。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，降鈣素基因相關(guān)肽抑制劑可有效緩解盤源性疼痛動物模型的疼痛［18］。在本實驗研究中，我們發(fā)現(xiàn)臭氧干預(yù)后，臭氧干預(yù)組的大鼠坐骨神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)的降鈣素基因相關(guān)肽表達(dá)較模型組的明顯下降。推測臭氧可能通過某種途徑抑制降鈣素基因相關(guān)肽的表達(dá)，降低疼痛敏感度，起到鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述，臭氧椎旁注射可以緩解盤源性疼痛模型大鼠的疼痛，但卻加重了其腰椎間盤的退變。臭氧椎旁注射可降低模型大鼠坐骨神經(jīng)及背根神經(jīng)節(jié)中腫瘤壞死因子-α和降鈣素基因相關(guān)肽的表達(dá)，可能通過抗炎作用、減少疼痛信號傳導(dǎo)達(dá)到鎮(zhèn)痛的效果。