超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測貉子肉中氯霉素、氟甲砜霉素的殘留量

趙雅楠 閆玉杰 楊趙偉 馬珊珊

河北省秦皇島市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心,河北秦皇島066004

氯霉素類藥物（Chloramphenicols，CAPs）主要包括氯霉素（Chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素（Thiamphnicol，TAP）和氟甲砜霉素（Florfenicol，F(xiàn)F），又稱為酰胺醇類，屬于廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑制作用，對家禽、家畜、水產(chǎn)品及蜂蜜制品傳染病的控制和治療具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，氯霉素可抑制骨髓細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，對人類和動(dòng)物的骨髓細(xì)胞和肝細(xì)胞具有毒性作用，不僅可引起細(xì)胞減少性貧血、血小板減少和再生障礙性貧血，還可導(dǎo)致嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)、二重感染、外周神經(jīng)炎、灰嬰綜合征等，長期微量攝入氯霉素不僅使沙門氏菌、大腸桿菌等產(chǎn)生耐藥性，而且還會(huì)導(dǎo)致機(jī)體正常菌群失調(diào)，使人們易患各種疾病。氟甲砜霉素的抗菌譜與氯霉素相似，但其抗菌活性優(yōu)于氯霉素，對大腸桿菌、沙門氏菌、克雷伯氏桿菌等有效，但其具有胚胎毒性[1-2]。隨著人們生活水平的提高，動(dòng)物性食品的食用安全越來越受關(guān)注。為保障動(dòng)物源食品的安全，確保該類藥物不對人類健康帶來威脅，世界各國都對其做出了嚴(yán)格規(guī)定，嚴(yán)禁氯霉素在食用動(dòng)物上使用，我國農(nóng)業(yè)部235 號公告中將氯霉素列為禁用藥物，規(guī)定氟甲砜霉素的在其他動(dòng)物組織中最高殘留限量為100 μg/kg。

動(dòng)物性食品中氯霉素殘留超標(biāo)主要是違法添加和環(huán)境污染所致?，F(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)大部分都采取集約化養(yǎng)殖，飼養(yǎng)密度過高，從而導(dǎo)致多種疾病的傳播。氯霉素雖然屬于禁用藥物，但由于其價(jià)格低、見效快，其違規(guī)使用現(xiàn)象仍然存在于畜禽養(yǎng)殖過程中；其次，由于飼喂的飼料、飲水等受到污染或是人為因素導(dǎo)致的藥物在飼料中殘留；此外部分養(yǎng)殖人員對相關(guān)法律法規(guī)和獸藥殘留危害認(rèn)識(shí)不夠，用藥過量或休藥期內(nèi)屠宰也會(huì)造成動(dòng)物性食品中氯霉素的殘留。

目前，關(guān)于氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素殘留的檢測方法包括微生物法、酶聯(lián)免疫法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等，但殘留檢測對象主要集中于蜂蜜、水產(chǎn)品以及肉、蛋、乳制品等[3]。本研究建立了一種針對貉子肉中氯霉素、氟甲砜霉素的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法，簡化了GB/T22338—2008 的前處理方法，優(yōu)化了液相和質(zhì)譜方法，能有效消除樣品在提取過程中的損失，縮短檢測時(shí)間，減少有機(jī)試劑消耗，為評估氯霉素、氟甲砜霉素在食用類貉子肉中殘留提供檢測參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1）試驗(yàn)樣品。從河北省秦皇島市昌黎縣下屬的10 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)選取各60 份屠宰取皮后的貉子肉，放于塑封袋里包好，-80 ℃冷凍保存。采樣地點(diǎn)和樣品編號見表1。

表1 貉肉采樣地點(diǎn)和樣品編號

2）試驗(yàn)儀器。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀UPLC XEVOTQ，Waters；CP214 電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；SB-5200DT 數(shù)控超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-20M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；SPT-16 氮空吹掃濃縮儀，北京斯珀特科技有限公司；GX274 固相萃取儀，法國吉爾森公司；固相萃取柱，200 mg，3 mL，Waters。

3）試劑。標(biāo)準(zhǔn)品：氯霉素，99.5%，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；氯霉素D5內(nèi)標(biāo)物，100 ng/mL，德國；氟甲砜霉素，100 μg/mL，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研檢測所。乙腈，色譜純，F(xiàn)isher；正己烷，色譜純，F(xiàn)isher；丙酮，色譜純，F(xiàn)isher；試驗(yàn)用水為一級水。

1.2 試驗(yàn)方法

1）樣品前處理。從河北省秦皇島市昌黎縣10 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)采取的貉子腿中隨機(jī)選取60 個(gè)樣品進(jìn)行檢測。稱取5.0 g 試樣于50 mL 離心管中，加入50 μL 1 μg/mL 氯霉素D5內(nèi)標(biāo)工作液和25 mL 乙腈，超聲提取10 min，8 000 r/min 離心10 min，吸取10 mL 上清液于另一個(gè)50 mL 離心管中，加入10 mL乙腈飽和正己烷，充分搖勻，靜置5 min，吸取5 mL乙腈層于10 mL 離心管中，氮?dú)獯蹈桑? mL 的丙酮-正己烷（體積比1∶9）溶解。

丙酮-正己烷（體積比1∶9）溶液5 mL 淋洗小柱，棄去淋洗液，加入殘?jiān)芙庖?，棄去流出液，加? mL 丙酮-正己烷（體積比6∶4）溶液，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈桑? mL 的20%乙腈溶液，過0.22 μm 濾膜后上機(jī)測定，同時(shí)制備空白基質(zhì)液和陽性添加樣品，采用與樣品相同處理方法。

2）色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：乙腈和一級水，洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

3）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（ESI-）；離子源溫度：150 ℃；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；毛細(xì)管電壓：2.60 kV；去溶劑氣：高純氮?dú)?；去溶劑氣流量? 000 L/h；去溶劑氣溫度：500 ℃；碰撞氣：氬氣；錐孔氣：高純氮?dú)猓诲F孔氣流量：50 L/h；氯霉素、氟甲砜霉素及氯霉素內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)表見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

通過反復(fù)試驗(yàn)梯度洗脫條件，實(shí)現(xiàn)了3 種物質(zhì)的分離，排除干擾，在5 min 之內(nèi)完成對藥物的檢測（表2）。本試驗(yàn)優(yōu)化的色譜條件，在流動(dòng)相中不添加乙酸銨，也能獲得良好的峰形及優(yōu)異的檢測靈敏度。

表3 質(zhì)譜采集參數(shù)表

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用不同的溶劑作為標(biāo)準(zhǔn)稀釋液或樣品處理后的復(fù)溶溶液會(huì)對質(zhì)譜響應(yīng)及色譜峰形產(chǎn)生顯著影響。比例過高的有機(jī)溶劑能明顯增強(qiáng)質(zhì)譜響應(yīng)，但同時(shí)也會(huì)造成部分化合物的色譜峰形坍塌。經(jīng)多次試驗(yàn)，確定以20%乙腈溶液作為樣品處理后復(fù)溶及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制用溶液，可獲得對稱、尖銳的峰形和良好的質(zhì)譜響應(yīng)。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

氯霉素類化合物因含有酚羥基，而適合在ESI源的負(fù)離子模式下離子化。在負(fù)離子化模式下，分別將3 種物質(zhì)以0.5 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。先通過母離子全掃描確定化合物的分子離子峰，以此作為母離子，再對離子源參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，比較不同錐孔電壓下的母離子強(qiáng)度，確定母離子達(dá)到最大響應(yīng)值時(shí)的最佳錐孔電壓值。然后對母離子作子離子全掃描，確定每種氯霉素類藥物的碎片離子信息，并選擇離子豐度較高、干擾較小的2 個(gè)特征碎片子離子作為各個(gè)目標(biāo)化合物的定性離子，同時(shí)對碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，確定碎片離子有最大響應(yīng)強(qiáng)度時(shí)的最佳碰撞電壓值，最后得到該化合物的2 個(gè)MRM 離子對及相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù),這與前人所操作類似試驗(yàn)得到的結(jié)果近似[4-6]。根據(jù)電離機(jī)制，以利于化合物去質(zhì)子化的乙腈作為有機(jī)相，可改善該類化合物在負(fù)離子模式下的離子化效率。試驗(yàn)驗(yàn)表明，與標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22338—2008 中以乙酸銨、乙腈和水為流動(dòng)相比較，單純以水和乙腈為流動(dòng)相時(shí)，氯霉素類化合物的響應(yīng)無明顯差異，因此，本方法選擇乙腈和水為流動(dòng)相，以減少有機(jī)鹽對色譜柱的損傷。

2.3 提取過程的優(yōu)化

預(yù)試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22338—2008 的前處理方法，添加檢測回收率達(dá)到58%，分析回收率偏低的原因，可能主要由于試驗(yàn)的前處理過程中分液漏斗使用過多及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溶液量較大造成的損耗。為提高樣品回收率，通過借鑒其他提取方法，經(jīng)過數(shù)次改進(jìn)，添加陽性樣品的回收率有了明顯的提高趨勢，達(dá)到68%～115%。

本試驗(yàn)使用的化合物屬于弱極性化合物，常用的提取溶劑涉及甲醇、乙腈、乙酸乙酯等，本試驗(yàn)只考察常用提取溶劑乙腈、乙酸乙酯的提取效果。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙腈與乙酸乙酯的提取回收率相當(dāng)；但用乙酸乙酯提取的溶劑顏色略深，說明溶液中帶出了一些弱極性基質(zhì)成分，這將增加后續(xù)凈化的難度；乙腈在有效提取目標(biāo)物的同時(shí)具有沉淀蛋白的作用，且?guī)С龅娜鯓O性成分大大減少，因而選用乙腈作為本研究的提取溶劑。

2.4 線性關(guān)系

準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL 的6 個(gè)質(zhì)量濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為10 ng/mL，按優(yōu)化好的條件進(jìn)行測定，得線性回歸方程，其相關(guān)系數(shù)均在0.999 以上，表明各化合物在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 檢測限與定量限

將加標(biāo)濃度逐級稀釋添加于空白樣品中測定信噪比，最終以3 倍信噪比確定該方法的檢測限，以10 倍信噪比確定該方法定量限，從而得出氯霉素和氟甲砜霉素的檢測限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg。

2.6 回收率和精密度

向空白樣品中添加0.5、1.0、2.0 μg/kg 3 個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平做4 個(gè)平行，試驗(yàn)結(jié)果表明，氯霉素平均回收率在68%～99%；氟甲砜霉素平均回收率在70%～115%，測定結(jié)果相對偏差均小于10%，相應(yīng)MRM 圖見圖1。

2.7 檢測結(jié)果

60 個(gè)被測樣品中，除了H83 檢出氯霉素含量（0.105 μg/kg）超過最低檢測限0.1 μg/kg 外，其余樣品均未檢出氯霉素和氟甲砜霉素，占被檢測樣品的1.5%。

3 討 論

圖1 貉子肉中氯霉素、氟甲砜霉素和氯霉素內(nèi)標(biāo)物D5 的MRM 圖

本研究建立了一種采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀對貉子肉中氯霉素、氟甲砜霉素的殘留量進(jìn)行定性和定量檢測的方法。以氘代氯霉素（D5-CAP）為內(nèi)標(biāo)，樣品經(jīng)乙腈提取，乙腈飽和正己烷除脂，固相萃取柱凈化后，采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）負(fù)離子模式，對貉子肉中氯霉素、氟甲砜霉素的殘留量進(jìn)行定量檢測。結(jié)果表明，2 種藥物在0.1～5.0 μg/mL 范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) 均大于0.999。樣品中氯霉素和氟甲砜霉素的檢測限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg，本方法在0.5～2.0 μg/kg 添加范圍內(nèi)藥物回收率為68%～115%，其相對偏差均小于10%。該方法具有簡便快捷、準(zhǔn)確度高、精密度好、損耗少和定量更準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)還對河北省秦皇島市昌黎縣10 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)貉子肉中氯霉素和氟甲砜霉素殘留數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，了解昌黎縣貉子肉中氯霉素類藥物的殘留狀況，評估食用貉子肉內(nèi)殘留，并對市場提出潛在風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警。