1例弓形蟲病的PCR鑒定與診治

舒鑫標 婁昆鵬

1．浙江大飛龍動物保健品股份有限公司，浙江金華321017；2．揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州225009

弓形蟲病又稱弓形體病, 是由剛地弓形蟲寄生在豬、牛、羊、狗、貓和人體內(nèi)而引起的一種人畜共患的專性細胞內(nèi)寄生原蟲病。豬的弓形蟲感染率較高，為3.32%～66.39%[1]。近年來豬弓形蟲病暴發(fā)較多,特別是種豬,由于生活周期長,感染機會多,天氣驟冷、更換飼料等應激容易誘發(fā)疫情。根據(jù)流行特點,本病多發(fā)生在5-10月,夏季發(fā)病率最高，寒冷的冬季也有發(fā)生?，F(xiàn)將浙江某豬場冬季母豬爆發(fā)弓形蟲病病例診治和防控措施報告如下：

1 發(fā)病情況

2018年12月，浙江某存欄300 余頭母豬場，第2 棟限位欄母豬開始有幾頭不吃料，后蔓延至整棟限位，很多母豬均有厭食情況?；钾i出現(xiàn)氣喘、咳嗽等癥狀，剛開始豬場技術人員按照豬流感進行治療，添加荊防敗毒散和阿莫西林進行治療，結(jié)果無效。12～24 h 后母豬陸續(xù)出現(xiàn)流產(chǎn)，流產(chǎn)胎兒潮紅且體表有針尖狀出血點。流產(chǎn)母豬以2～4 胎較多，流產(chǎn)后母豬癥狀有所減輕。第2 天第1 頭母豬死亡，保育豬亦有傷亡。之后豬場技術人員又按照藍耳病對患病豬只進行處理，添加替米考星等，注射頭孢、氟苯尼考等均未見到明顯效果。至筆者接到案例時發(fā)病已3 周，病豬流產(chǎn)比例占孕豬總數(shù)超過10%，流產(chǎn)、返情比例和弱仔比例明顯高于平時。

2 臨床癥狀

病豬體溫40～42 ℃，呈稽留熱，眼結(jié)膜潮紅，分泌物增多；精神萎靡，減食或食欲廢絕，個別嘔吐，喜臥，被毛粗亂，大便秘結(jié)如栗，尿液茶褐色。病豬呈現(xiàn)明顯的呼吸道癥狀，呼吸急促，兼有咳嗽，呈腹式呼吸，嚴重的張口呼吸，呈犬坐姿勢，流漿液性、粘液性鼻液。耳根、鼻端、腹內(nèi)側(cè)呈現(xiàn)紅紫色斑塊，兼有出血點，嚴重的甚至遍布全身。有的后軀麻痹、運動障礙。發(fā)病保育豬腹股溝及頜下淋巴結(jié)腫大，后期臥地不起、體溫下降，最終衰竭死亡，部分病豬瀕死期嘴角流出血色泡沫。

3 病理變化

剖檢病死母豬仔豬共5 頭，腹下和四肢內(nèi)側(cè)皮膚多見紫紅色斑塊。全身淋巴結(jié)特別是肺門、肝門和腸系膜淋巴結(jié)腫大，切面出血、有灰白色壞死。胸腔和腹腔大量積液、呈淡黃色。心肌柔軟、外膜有少量出血點、心耳出血。肺臟腫大，呈暗紅色，間質(zhì)增寬，充滿半透明膠凍樣滲出物，切面流出紅黃色泡沫液體。肝臟腫大、色暗紅，有大量白色或灰黃色小米粒樣壞死結(jié)節(jié)。腎臟表面有針尖大小出血點。脾臟腫大，棕紅色，表面有結(jié)節(jié)樣出血性梗死。胃底潮紅、充血、出血。

4 實驗室診斷

4.1 涂片染色鏡檢

無菌操作取病豬肺、肝、淋巴結(jié)做涂片，用姬姆薩染色液染色后，油鏡下檢查發(fā)現(xiàn)月牙形或梭形的弓形蟲蟲體，核為紅色，細胞質(zhì)為藍色。

4.2 細菌培養(yǎng)

無菌操作取病死豬肝、脾、淋巴組織分別涂抹接種普通營養(yǎng)瓊脂、鮮血營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)，觀察至48 h，無細菌生長。

4.3 PCR 鑒定

無菌條件下采取13 頭病死豬心臟血液，以弓形蟲（TP）1 基因作為分子標記建立PCR 檢測[2]。同時用PCR 方法檢測豬偽狂犬病毒（PRV）、圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、細小病毒（PPV）。用RT-PCR 方法檢測豬藍耳病毒（PRRSV）和豬瘟病毒（CSFV），參考浙江省農(nóng)業(yè)科學院豬病檢測室診斷方法設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物名稱、序列及預期片段大小如表1。檢測結(jié)果見圖1。

抗原PCR 檢測結(jié)果見表2。由表2可知，13 個樣品的豬藍耳病毒、圓環(huán)病毒2 型、豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒、細小病毒抗原檢測均為陰性，說明此次疫情并非上述疾病引起，而弓形蟲抗原檢測陽性數(shù)為11 個，占比84.6%（11/13）。結(jié)合臨床癥狀、病理變化和實驗室診斷，確診該病為豬弓形蟲病。

表1 引物名稱、序列及預期片段大小

圖1 PCR 檢測電泳圖譜

表2 抗原PCR 檢測結(jié)果統(tǒng)計

5 防治措施

立即將病豬與假定健康、精神狀態(tài)好的豬隔離，單獨飼養(yǎng)，對病程長、嚴重的和治療效果不佳的豬進行淘汰并作無害化處理。降低豬舍濕度，保持豬舍清潔干燥，全進全出，定期用3%氫氧化鈉溶液對墻面、地面、器具和糞溝徹底消毒，用聚維酮碘對豬噴霧消毒。豬場禁止養(yǎng)犬、貓，做好滅鼠工作。全群投喂“弓連優(yōu)”（浙江某獸藥廠家生產(chǎn)，通用名復方磺胺甲惡唑粉），按照說明書治療量使用，每噸飼料添加1 kg，另等量添加碳酸氫鈉，以減少對泌尿道的不良反應，連用7 d。飲水中添加葡萄糖和電解多維，連用14 d。對采食量低、發(fā)熱的患病豬按照每千克體質(zhì)量0.1 mL 劑量肌肉注射“聯(lián)合黃安”（浙江某獸藥廠家生產(chǎn)，通用名磺胺間甲氧嘧啶注射液），首次用量加倍。同時配合柴胡注射液使用，1 次/d，連打3 d。用藥4 d 后，不再有新增病例，采食量逐漸增加，患豬體溫逐漸恢復正常，7 d 后大群精神狀態(tài)恢復正常。

6 討 論

豬弓形蟲病多在炎熱的夏季發(fā)病，本次為冬季發(fā)病，此種情況少見。通過現(xiàn)場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，豬場衛(wèi)生狀況不佳，未及時清理的糞污點較多，新粉碎的配合料雜亂堆放并有暴露。據(jù)飼養(yǎng)員介紹，豬場內(nèi)及豬圈舍經(jīng)常有野貓出入，在豬場飼料房也能看到疑是貓糞的動物糞便。從天氣看，發(fā)病期間陰雨連綿，氣溫較低，豬圈舍密閉開啟暖風機，溫度適宜，但濕度大，上述狀況都為蟲體滋生創(chuàng)造了條件，是否豬采食污染貓糞的飼料或由飲水導致發(fā)病有待進一步考證。

弓形蟲病是一種危害很大的人獸共患病，人和動物感染弓形蟲很常見[3]。研究弓形蟲病具有重要的公共衛(wèi)生意義。孕婦若妊娠前3 個月感染弓形蟲可引起流產(chǎn)、胎兒畸形或產(chǎn)出弱智兒[4]。目前隨著家庭寵物犬貓飼養(yǎng)量的增加，人類與寵物密切接觸的機會增多，弓形蟲的感染率有逐年增加的趨勢[5]。弓形蟲感染成人后，可侵害神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心臟、淋巴內(nèi)皮系統(tǒng)等多種器官或系統(tǒng)，并造成損傷，嚴重時會造成死亡。弓形蟲能感染大部分溫血動物，可致孕畜流產(chǎn)死胎，急性弓形蟲病可造成家畜的死亡，貓科動物是弓形蟲終末宿主，貓在該病的流行和傳播中起重要作用。因此，豬場禁止養(yǎng)貓、嚴防野貓及排泄物污染飼料及飲水；做好滅鼠工作，禁止豬接觸老鼠或其他動物尸體；禁止屠宰下腳料和生肉湯水喂豬；流產(chǎn)母豬胎衣、胎兒焚燒處理，以防豬吃到患病或帶蟲動物體內(nèi)的滋養(yǎng)體和包囊而感染。北方部分養(yǎng)豬場有從周邊農(nóng)戶購買散裝玉米的習慣，豬場若發(fā)生疑是弓形蟲病時應格外注意留意飼料糧是否被貓糞污染。

弓形蟲的高熱、全身紫紅和呼吸道表現(xiàn)，雖然有一定示病意義，但因與豬瘟、藍耳病、鏈球菌病、豬肺疫等臨床表現(xiàn)有諸多相似之處，難以區(qū)分，往往容易誤診漏診。如條件允許，建議進行實驗室鏡檢和PCR 鑒定，以確定病原[6]。目前，有關弓形蟲的研究大量集中于豬血清中弓形蟲抗體方面，這些方法并不能準確反映豬體弓形蟲的感染狀況[7-8]。隨著PCR 技術的快速發(fā)展，對弓形蟲感染組織的檢測敏感度已經(jīng)能夠達到0.05 個速殖子水平[9]。但因PCR檢測所需組織樣本較小，而且慢性感染的動物一般在腦部形成組織包囊，這給陽性組織的尋找?guī)砹艘欢ɡщy，容易造成漏檢。如何解決這方面的問題將是未來弓形蟲檢測的重點。

絕大多數(shù)抗生素對弓形蟲無效，目前臨床上治療弓形蟲病最有效的方法是使用磺胺類藥物，早期診斷和早期治療能收到較好效果，治療時用藥劑量要足，首次用量加倍，療程要夠，一個療程需5～7 d，不能病情見好就停藥，這種情況極易復發(fā)，繼續(xù)治療難度很大。臨床用藥較晚雖能控制臨床表現(xiàn)和癥狀，但不能控制蟲體進入組織形成包囊，造成病豬成為帶蟲豬，給豬群帶來再次發(fā)病的風險。

賣完雞，進雞苗前怎樣給雞舍徹底消毒？

①肉雞出欄后，清出雞舍內(nèi)所有廢棄物，用高壓水槍沖洗雞舍干凈，包括地面、網(wǎng)子、用具、墻壁、頂棚等。尤其注意清洗網(wǎng)上殘留的雞糞，也可用鐵刷擦洗。

②飲水管線的消毒：將水管拆卸下來，放出殘余的水，并用高壓水槍沖洗，沖洗水箱等應用洗潔球或海綿擦洗，待全部擦洗干凈后，再用1%～2%稀鹽酸水溶液充滿水線，浸泡24 h，放出浸泡液后用清水沖洗干凈。

③待雞舍干燥后，再用高壓水槍噴灑消毒藥水(可選用含碘或含氯消毒劑等)。噴灑應包括雞舍內(nèi)所有用具及雞舍外周圍環(huán)境及與本雞舍有聯(lián)系的設備、車輛等。

④再次檢修設備，并調(diào)試使其全部處于完好狀態(tài)，將雞舍內(nèi)所有用具放入雞舍，用廢報紙或膠帶密閉所有門窗，后用固體甲醛或戊二醛薰蒸消毒。雞舍密閉24 h 后，打開門窗通風。