外周血Th17細(xì)胞在卵巢子宮內(nèi)膜異位患者中的作用

楊富群 孫桂蓉

子宮內(nèi)膜異位是一種臨床常見的婦科疾病，其主要類型多見于卵巢子宮內(nèi)膜異位，高發(fā)于育齡期婦女，相關(guān)研究顯示，其發(fā)生率在10%～15%[1]。關(guān)于子宮內(nèi)膜異位的發(fā)病機(jī)制，假說眾多，其中炎性反應(yīng)在其中具有重要作用[2]。子宮內(nèi)膜細(xì)胞經(jīng)輸卵管進(jìn)入盆腔，黏附于卵巢，形成一個(gè)微小的異位病灶，引起炎性細(xì)胞向該部位聚集[3]。有研究顯示，子宮內(nèi)膜異位患者子宮在位、異位內(nèi)膜組織及腹腔液中炎性因子水平明顯升高，主要表現(xiàn)為腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素-1β等[4,5]。機(jī)體免疫應(yīng)答是調(diào)控炎性反應(yīng)，在促進(jìn)炎性細(xì)胞分泌炎性因子過程中，發(fā)揮重要作用[6]。輔助性T細(xì)胞17(Th17)是一類重要的淋巴細(xì)胞亞群，其通過特異性分泌IL-17，參與機(jī)體免疫及炎性反應(yīng)[7]。相關(guān)研究顯示，在膿毒癥及自身免疫性疾病等患者中，其外周血Th17細(xì)胞及IL-17水平明顯升高，參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，同時(shí)對(duì)于疾病的診斷及預(yù)后評(píng)估，具有重要的臨床價(jià)值[8,9]。Th17細(xì)胞是否參與了卵巢子宮內(nèi)膜異位的發(fā)生、發(fā)展，目前尚不清楚。因此，本研究以卵巢子宮內(nèi)膜異位患者為研究對(duì)象，檢測(cè)其外周血Th17細(xì)胞及IL-17水平，探討Th17細(xì)胞在卵巢子宮內(nèi)膜異位發(fā)病中的作用，為該疾病的臨床診治提供依據(jù)和線索。

資料與方法

1.臨床資料:選取四川省彭州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科在2014年1月～2018年9月收治住院，經(jīng)手術(shù)并病理檢查證實(shí)為卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者185例為觀察組，取其異位內(nèi)膜組織，其中該組患者年齡25～49歲，中位年齡35.1歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：月經(jīng)周期規(guī)律的育齡期婦女；術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未接受性激素類藥物治療的患者；無嚴(yán)重感染、子宮腺肌病、子宮肌瘤、自身免疫疾病及惡性腫瘤等疾病的患者；所有患者均簽署知情同意。子宮內(nèi)膜異位癥根據(jù)美國生育學(xué)會(huì)分期標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行分期，分為Ⅰ期(41例)、Ⅱ期(46例)、Ⅲ期(48例)、Ⅳ期(50例)[10]。選取在筆者醫(yī)院住院手術(shù)經(jīng)病理檢查為卵巢囊腫的非子宮內(nèi)膜異位患者60例，取其在位內(nèi)膜組織，其中該組患者年齡21～50歲，中位年齡34.7歲。同時(shí)另取11例經(jīng)手術(shù)并病理檢查證實(shí)為卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜組織，該組患者年齡22～48歲，中位年齡33.5歲。選取同期在筆者醫(yī)院行健康體檢的健康女性為對(duì)照組(60例)，其中年齡21～50歲，中位年齡35.3歲。各組間在年齡、體重指數(shù)等方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。四川省彭州市人民醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)審核并批準(zhǔn)了本實(shí)驗(yàn)研究，同時(shí)研究對(duì)象簽署了書面知情同意。

2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Th17細(xì)胞水平：首先制備樣本，分別于月經(jīng)干凈后3天，抽取卵巢異位、卵巢囊腫患者及健康對(duì)照組清晨空腹靜脈血5ml，充分肝素抗凝后，提取單核細(xì)胞。在無菌操作臺(tái)中，將上述單核細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)板中含RPMI-1640培養(yǎng)基，同時(shí)加入抗菌素(佛波酯，劑量30μl，濃度1μg/ml)，培養(yǎng)箱中孵育5h。收集上述細(xì)胞，加入抗人CD4單克隆抗體10μl，震蕩混勻，室溫避光孵育30min后，加入2ml破膜液，靜置離心后(1000×g，5min，室溫)，吸去上清，加入IL-17單克隆抗體10μl，震蕩混勻后，加入多聚甲醛固定，待上機(jī)檢測(cè)。

3.外周血IL-17和CRP的水平的檢測(cè):抽取卵巢異位、卵巢囊腫患者及健康對(duì)照組清晨空腹靜脈血5ml，離心后收集血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(南京建成生物技術(shù)公司)測(cè)定上述各組間外周血IL-17水平；采用快速免疫比濁法檢測(cè)各組間CRP水平。

4.qRT-PCR檢測(cè)特異性轉(zhuǎn)錄因子RORy-γt mRNA水平:采用qRT-PCR方法檢測(cè)卵巢子宮內(nèi)膜在位、異位內(nèi)膜組織和卵巢囊腫組在位內(nèi)膜組織特異性轉(zhuǎn)錄因子RORy-γt mRNA表達(dá)水平。先用TRIzol法提取組織中mRNA，在核酸分析儀上測(cè)定提取的RNA濃度，按照TaKaRa試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，設(shè)計(jì)RORy-γt及GAPDH引物：RORy-γt：上游引物：5′-GCAAGGAAGTATTTGGGCAC-3′，下游引物：3′-AATACCCTAAADDDACACCC-5′；GAPDH：上游引物：5′-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3′，下游引物：3′-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-5′。設(shè)qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s，95℃變性10s，60℃退火30s，進(jìn)行39個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算RORy-γt mRNA相對(duì)表達(dá)量。

結(jié) 果

1.不同組間外周血Th17細(xì)胞及相關(guān)臨床指標(biāo)的比較:與卵巢囊腫組及健康對(duì)照組比較，觀察組外周血Th17細(xì)胞、IL-17及CRP均明顯升高，但在卵巢囊腫組和健康對(duì)照組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1、圖1。

表1 不同組間外周血Th17細(xì)胞及相關(guān)臨床指標(biāo)比較

與健康對(duì)照組比較，*P<0.05；與卵巢囊腫組比較，#P<0.05

2.不同期別觀察組間外周血Th17細(xì)胞及相關(guān)臨床指標(biāo)的比較:檢測(cè)觀察組不同期組間外周血Th17細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子IL-17比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，Ⅳ期組外周血Th17細(xì)胞和IL-17水平最高，Ⅲ期、Ⅱ期及Ⅰ期組逐漸降低。各期別組間CRP 水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P >0. 05) ，詳見表2。

圖1 不同組間外周血Th17細(xì)胞水平

表2 不同期別組間外周血Th17細(xì)胞及相關(guān)臨床指標(biāo)比較

t1,P1.Ⅰ期和Ⅱ期比較；t2,P2.Ⅱ期和Ⅲ期比較；t3,P3.Ⅲ期和Ⅳ期比較

3.卵巢子宮內(nèi)膜異位與卵巢囊腫組內(nèi)膜組織RORy-γt mRNA表達(dá)水平比較:與卵巢囊腫組比較，卵巢子宮內(nèi)膜在位和異位內(nèi)膜組織RORy-γt mRNA表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)異位內(nèi)膜RORy-γt mRNA表達(dá)明顯高于在位內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 各組內(nèi)膜組織RORy-γt mRNA表達(dá)水平比較與卵巢囊腫組比較，*P<0.05；與卵巢子宮內(nèi)膜異位組在位內(nèi)膜比較，#P<0.05

4.ROC曲線分析外周血Th17細(xì)胞對(duì)卵巢子宮內(nèi)膜異位分期中的診斷價(jià)值：通過以外周血Th17細(xì)胞水平來評(píng)估卵巢子宮內(nèi)膜異位病情嚴(yán)重程度，繪制ROC曲線，計(jì)算曲線下面積(AUC)，其結(jié)果為0.843(95%CI：0.752～0.908)，同時(shí)臨界值即最佳工作點(diǎn)(OOP)為6.9%，按此臨界值對(duì)卵巢子宮內(nèi)膜異位分期嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)估，其敏感度和特異性分別為83.4%和79.0%(圖3)。

圖3 外周血Th17細(xì)胞對(duì)卵巢子宮內(nèi)膜異位分期的ROC曲線

討 論

子宮內(nèi)膜異位是一種常見的婦科疾病，與機(jī)體炎性反應(yīng)密切相關(guān)[2]。在正常女性體內(nèi)，子宮內(nèi)膜細(xì)胞若逆流逸入盆腔，機(jī)體可通過自身免疫細(xì)胞識(shí)別，將其清除，而子宮內(nèi)膜異位患者往往體內(nèi)免疫功能異常，導(dǎo)致逸入盆腔的子宮內(nèi)膜細(xì)胞清除障礙。目前，對(duì)于子宮內(nèi)膜異位特別是卵巢子宮內(nèi)膜異位的發(fā)病機(jī)制及診斷仍缺乏敏感度和特異性的指標(biāo)。傳統(tǒng)炎性標(biāo)志物如C反應(yīng)蛋白、中性粒細(xì)胞比例，對(duì)于卵巢子宮內(nèi)膜異位的診斷特異性較差，同時(shí)并不能有效的的反映卵巢子宮內(nèi)膜異位的分期即病情嚴(yán)重程度[11,12]。因此，尋找一種能準(zhǔn)確診斷并預(yù)測(cè)卵巢子宮內(nèi)膜異位病情嚴(yán)重程度的有效指標(biāo)，具有重要的臨床意義。

關(guān)于子宮內(nèi)膜異位發(fā)病機(jī)制的假說眾多，其中，機(jī)體自身免疫功能異常，越來越得到重視[13]。有研究顯示，在子宮內(nèi)膜異位患者體內(nèi)，外周血及子宮異位局部組織T細(xì)胞和B細(xì)胞功能異常，同時(shí)數(shù)量顯著增多，繼而引起抗子宮內(nèi)膜抗體滴度顯著升高，從而提示機(jī)體自身免疫功能的異常參與了子宮內(nèi)膜異位的發(fā)生、發(fā)展過程[14]。在免疫反應(yīng)的調(diào)控中，CD4+T淋巴細(xì)胞具有重要作用，而Th17細(xì)胞作為一種由CD4+T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來的輔助性T細(xì)胞亞群，可以特異性的分泌致炎因子IL-17，促進(jìn)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15]。相關(guān)研究顯示，Th17細(xì)胞參與了多種疾病如自身免疫性疾病、惡性腫瘤等的發(fā)生、發(fā)展過程[16,17]。子宮內(nèi)膜異位作為一種炎性疾病，其發(fā)病機(jī)制是否與Th17細(xì)胞有關(guān)，其體內(nèi)Th17細(xì)胞及IL-17表達(dá)水平如何，目前尚未闡明。本研究結(jié)果顯示，卵巢子宮內(nèi)膜異位患者外周血Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子(IL-17)水平顯著較卵巢囊腫組和對(duì)照組升高，同時(shí)卵巢子宮內(nèi)膜異位組患者異位內(nèi)膜RORy-γt mRNA表達(dá)水平較卵巢囊腫組明顯升高。RORy-γt作為Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，有研究顯示，其升高水平與Th17細(xì)胞的活性呈正相關(guān)[18]；同時(shí)有研究顯示，在子宮內(nèi)膜異位患者異位內(nèi)膜RORy-γt mRNA顯著較子宮卵巢囊腫組升高，說明子宮內(nèi)膜異位患者體內(nèi)Th17細(xì)胞呈高度活化狀態(tài)[19]。因此，本研究結(jié)果表明，卵巢子宮內(nèi)膜異位患者體內(nèi)免疫功能存在異常，機(jī)體呈現(xiàn)一種炎性狀態(tài)，Th17細(xì)胞可能參與并促進(jìn)了該疾病的發(fā)生過程。通過對(duì)卵巢子宮內(nèi)膜異位按疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行分期，進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，患者外周血Th17細(xì)胞和IL-17水平與臨床分期密切相關(guān)，其病情越重，外周血Th17細(xì)胞和IL-17水平越高。有研究顯示，子宮內(nèi)膜異位患者機(jī)體活化的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增多同時(shí)伴有功能的異常，主要表現(xiàn)為多種細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)及活性的改變，包括巨噬細(xì)胞遷移抑制因子、TNF-α等水平明顯升高，并且與疾病分期呈正相關(guān)。

本研究通過進(jìn)一步ROC曲線分析，結(jié)果顯示以外周血Th17細(xì)胞診斷截點(diǎn)為6.9%時(shí)，其評(píng)估卵巢子宮內(nèi)膜異位患者病情嚴(yán)重程度的敏感度為83.4%和特異性為79.0%。已有研究表明，通過有效的抑制腫瘤或自身免疫性疾病患者體內(nèi)Th17細(xì)胞的活性，可以顯著降低體內(nèi)炎性細(xì)胞因子水平，從而降低炎性反應(yīng)。針對(duì)卵巢子宮內(nèi)膜異位患者，外周血Th17細(xì)胞水平，其與患者發(fā)病及病情分期有關(guān)，但是否可作為治療卵巢子宮內(nèi)膜異位的有效靶標(biāo)，還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)本研究子宮內(nèi)膜異位患者在位內(nèi)膜病例數(shù)偏少，下一步需加大樣本量，證實(shí)Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子是否在子宮內(nèi)膜異位患者在位內(nèi)膜與異位及正常人群在位內(nèi)膜間存在差異。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，外周血Th17細(xì)胞水平在卵巢子宮內(nèi)膜異位患者中明顯升高，其可能調(diào)控下游炎性細(xì)胞因子水平，促進(jìn)卵巢子宮內(nèi)膜異位的發(fā)生和發(fā)展。但如何引起外周血Th17細(xì)胞水平升高的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。