載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層螺釘治療股骨頸骨折的實驗研究

韓 寧 劉小翠 丁佳駿 劉圣珺 梁素萍 徐佳依 李增春

股骨頸骨折約占全部骨折總數(shù)的3.58%，且發(fā)生率日益增高，預計到2025年，全球股骨頸骨折數(shù)量將突破400萬例[1]。而股骨頸骨折臨床治療中的骨折不愈合和股骨頭缺血壞死，常導致患者病殘[2，3]。

目前，解剖復位股骨頸骨折并加壓固定骨折端已經(jīng)形成共識[1]。早期骨折復位有助于恢復因骨折而扭曲的殘存股骨頭血供；牢固的內(nèi)固定可避免骨折端再次移位造成血供破壞，為微血管的再生爬行提供良好環(huán)境[4,5]。但股骨頸骨折術(shù)后骨折不愈合發(fā)生率仍高達10%～30%，股骨頭缺血性壞死發(fā)生率約為15%～30%[6]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種特異性促血管內(nèi)皮細胞增生及血管生成因子，對血管再生起著關(guān)鍵性作用[7，8]。骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)被認為是活性最強的唯一能單獨誘導成骨的因子，在骨的生長和損傷修復中發(fā)揮重要作用[8]。因此，筆者在內(nèi)固定表面制備具有生物活性的BMP-2和VEGF涂層，誘導股骨頸骨折端和股骨頭內(nèi)微血管和新骨形成，促進股骨頸骨折愈合避免股骨頭缺血壞死。

材料與方法

1.材料:新西蘭大白兔和昆明小鼠由同濟大學動物中心提供。高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自以色列Beit Haemek有限公司，含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，人重組VEGF和人重組BMP-2標準品(美國Sigma公司)，培養(yǎng)瓶，24孔板(美國Corning公司)，紫外光分光光度儀(德國Eppendoff公司)。

2.PDLLA涂層的體外釋放檢測：聚消旋乳酸[poly(D，L-lactide)，PDLLA]以50mg/ml的濃度在室溫下溶解在有機溶劑乙酸乙酯中。100μg人重組VEGF和100μg人重組BMP-2標準品分別混勻于5ml PDLLA溶液中，充分浸泡無菌直徑3.5mm不同長度的鈦合金螺釘并在無菌層流條件下風干，此過程重復兩次。60Co輻照滅菌，無菌包裝備用。

配制VEGF和BMP-2對照品液，以磷酸鹽緩沖液(PBS)為空白，紫外分光光度計在200～700nm范圍內(nèi)分別確定VEGF和BMP-2的最大吸收波長。分別精密稱取VEGF和BMP-2對照品0.05g置100ml容量瓶中，以PBS定容，得到500μg/ml的溶液，然后分別稀釋，得到濃度分別為400、300、200、100、50、20、10μg/ml一系列標準溶液。分別用紫外分光光度計測定吸光度值，制備標準曲線。

將載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層鈦合金螺釘，浸入含20ml磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值=7.4)的培養(yǎng)瓶中，于37℃恒溫振蕩(60r/min)水浴中，在預定的時間間隔點(1h、4h、8h、12h、1天、14天、28天、56天、84天)各取出100μl。用紫外分光光度計測定釋放液吸光度，對照標準曲線，計算VEGF和BMP-2的含量。每個樣品分別測定3次。

3.載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層螺釘?shù)纳锵嗳菪裕篋MEM高糖培養(yǎng)液(含10%小牛血清)浸提VEGF和BMP-2的PDLLA涂層鈦合金螺釘(依照GB/T 16886和ISO 10993，材料質(zhì)量與浸提介質(zhì)體積比1g∶5ml)，浸提條件為37℃，72h，后以1200r/min離心5min，吸取上清液并經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即得實驗用樣品的浸提液備用。

4.體內(nèi)全身急性毒性檢測、熱原反應和溶血實驗:依據(jù)GB/T 16886和ISO 10993醫(yī)療器械生物學評價規(guī)定，進行體內(nèi)全身急性毒性檢測、熱原反應和溶血實驗。

(1)全身急性毒性檢測：選用健康昆明小鼠12只，6周齡，雌雄各半，體質(zhì)量15～26g。將小鼠隨機分實驗組和對照組兩組，每組6只。實驗組小鼠腹腔注射樣品浸提液，每只小鼠注射劑量為50ml/kg；對照組腹腔注射無菌0.9%NaCl注射液50ml/kg，于注射后即刻及24、48、72h觀察和記錄實驗組和對照組動物一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡動物數(shù)。于注射前及注射后24、48、72h稱重并記錄兩組動物的體質(zhì)量變化。

(2)熱原反應：選用健康成熟新西蘭大白兔12只，雌雄不限，體質(zhì)量2.2～2.5kg，隨機分實驗組和對照組2組，每組6只。自實驗組新西蘭大白兔耳緣靜脈靜脈注射溫度為38℃的樣品浸提液(10ml/kg)，對照組耳緣靜脈注射溫度為38℃的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(10ml/kg)。注射后每隔1h測量體溫1次(測體溫時用精確肛溫計插入新西蘭大白兔肛門約6cm左右，測溫時間1.5min)，共3次，3次體溫中最高的1次減去注射前體溫即為體溫升高值。若體溫升高<1.4℃說明沒有致熱源物質(zhì)存在。

(3)溶血實驗：選用新西蘭大白兔6只，雌雄不限，體質(zhì)量2.2～2.5kg。抽取健康新西蘭大白兔靜脈血10ml，加入2%草酸鉀0.5ml，以0.9%生理鹽水10ml稀釋制備新鮮稀釋兔血。將實驗組(樣品浸提液)、陰性對照組(生理鹽水)、陽性對照組(雙蒸水)各組試液10ml分別置于50ml三角瓶中，37℃水浴30min。加入新鮮稀釋兔血0.2ml搖勻，37℃水浴60min，以2000r/min離心5min取上清，紫外分光光度計于波長545nm測吸光度，實驗組和對照組吸光度均取3瓶平均值。溶血程度用溶血率(%)表示，為[(實驗樣品的吸光度值-陰性對照的吸光度值)/(陽性對照的吸光度值-陰性對照的吸光度值)]×100%。若實驗組溶血率>5%為陽性反應，表示有溶血現(xiàn)象。

5.體外細胞毒性實驗:(1)骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)及傳代擴增：密度梯度離心聯(lián)合差速貼壁法分離新西蘭大白兔的骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSC)。于新西蘭大白兔髂骨穿刺獲得骨髓重懸于DMEM高糖完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)，充分混勻后疊加到10ml percoll分離液(d=1.073g/ml)上層液面，900×g離心20min。PBS洗滌中間單核細胞層兩次，單細胞懸液以5×108/ml接種于25cm2培養(yǎng)瓶。置37℃、相對體積分數(shù)為5%CO2、飽和濕度的細胞孵箱培養(yǎng)48～72h后全量換液，棄去未貼壁細胞，以后每2～3天換液1次。生長至80%融合后以含0.02%EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化傳代。取2×104個/毫升第3代BMSC細胞懸液備用。(2)細胞毒性實驗：96孔板內(nèi)設(shè)實驗組、陽性對照組和陰性對照組，每組6復孔。每孔接種100μl第3代BMSC細胞懸液后，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后棄去原培養(yǎng)液，PBS沖洗。實驗組加入200μl材料浸提液，陽性對照組加入200μl含0.64%苯酚和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，陰性對照組加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48和72h后各取一塊培養(yǎng)板，各孔加入20μl的5%MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去孔內(nèi)液體并加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10～15min，波長490nm處自動酶標檢測儀測吸光度。根據(jù)6級毒性評級標準計算各組相對增殖率(relative proliferation rate，RGR)，RGR=實驗組吸光度值/陰性對照組吸光度值。

6.新西蘭大白兔股骨頸骨折動物模型的建立和分組：健康成熟新西蘭大白兔12只，一級動物，雌雄各半，體質(zhì)量2.5～3.9kg。將兔的右后肢作為實驗側(cè)，左后肢作為自身對照側(cè)。實驗側(cè)應用直徑3.5mm載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層螺釘固定；而對照側(cè)以直徑3.5mm螺釘固定。10%戊巴比妥鈉25mg/kg靜脈注射麻醉，開通靜脈補液通道。新西蘭大白兔俯臥位，常規(guī)備皮，消毒鋪巾。取雙側(cè)髖關(guān)節(jié)外側(cè)弧形切口，長約5cm，依次切開皮膚、皮下、深筋膜，內(nèi)旋下肢切斷外旋肌群，保護坐骨神經(jīng)，十字切開關(guān)節(jié)囊，顯露股骨頸，微型擺鋸于股骨頸基底部橫行截斷股骨頸，直視下復位，經(jīng)股骨矩向股骨頭鉆孔、測深并置入直徑3.5mm載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層螺釘1枚固定。重新消毒鋪巾，相同技術(shù)制作左側(cè)股骨頸骨折，經(jīng)股骨矩向股骨頭鉆孔、測深并置入3.5mm普通螺釘1枚固定作為對照組。術(shù)后允許自由活動，自由飲食。術(shù)后3日內(nèi)每日予青霉素80萬單位肌內(nèi)注射。術(shù)后兩周拆線。

7.檢測方法：(1)髖關(guān)節(jié)X線檢測：術(shù)后12周，取俯臥位攝髖關(guān)節(jié)X線片，所有攝片均采用同批底片，曝光條件相同(電壓55kV、電流55mA，曝光時間0.3s，焦距90cm)，觀察股骨頸骨折愈合過程及股骨頭密度變化。(2)micro-CT檢測:術(shù)后12周，麻醉狀態(tài)下處死新西蘭大白兔將雙側(cè)股骨近端完整取出，去除固定螺釘，各組標本行體外高分辨率micro-CT掃描。球管電壓 80kV，電流 80mA，曝光時間 3000ms，分辨率14mm，旋轉(zhuǎn)角度360°，旋轉(zhuǎn)角度增量0.5°。使用美國GE公司配套軟件對標本進行三維重建，在股骨頸和股骨頭內(nèi)以直徑3mm，高6mm圓柱形區(qū)域作為感興趣(ROI)。分析骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間距(Tb.Sp)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨體積分數(shù)(BV/TV)。

8.組織學分析:甲醛固定標本，流水沖洗過夜，10% EDTA溶液脫鈣2周。標本流水沖洗過夜，乙醇梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚約5μm，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察術(shù)后12周骨折的愈合、股骨頭缺血反應及修復。用計算機輔助圖像分析系統(tǒng)以5個隨機200倍視野血管的均數(shù)表示該組織的微血管密度，檢測股骨頭內(nèi)微血管變化。

結(jié) 果

1.PDLLA涂層的體外釋放檢測:取20μg/ml含VEGF和BMP-2的PDLLA溶液5ml，將直徑3.5mm皮質(zhì)骨螺釘充分浸泡，并在無菌層流條件下風干螺釘，此過程重復兩次。VEGF和BMP-2在最初的8h內(nèi)藥物是爆發(fā)性的釋放，隨后是比較持續(xù)和穩(wěn)定的釋放，并且釋放可以持續(xù)12周。術(shù)后1h、4h、8h、12h、1天、14天、28天、56天和84天PDLLA涂層螺釘中VEGF緩釋量分別為1.16±0.10、2.28±0.44、15.99±1.41、19.09±0.98、19.51±0.80、19.87±0.75、21.20±0.63、34.84±1.22、47.62±1.46mg/L。術(shù)后1h、4h、8h、12h、1天、14天、28天、56天、84天 PDLLA涂層螺釘中BMP-2緩釋量分別為1.21±0.36、2.50±0.41、17.51±0.70、19.28±0.59、19.46±0.62、20.43±0.55、21.37±0.33、32.04±0.89、40.72±2.01mg/L。

2.載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層螺釘?shù)纳锵嗳菪裕?1)體內(nèi)全身急性毒性檢測、熱原反應和溶血實驗：在72h觀察期內(nèi)，對照組和實驗組小鼠一般情況良好，活動、食欲正常，呼吸平穩(wěn)，無驚厥、腹瀉、癱瘓和動物死亡等毒性反應。實驗組(0.40±0.22)和對照組(0.40±0.26)體溫升高，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義，且體溫升高值<1.4℃，該樣品符合熱原檢查的規(guī)定。浸提液溶血率0.96%，低于GB/T 16886和ISO 10993規(guī)定的5%，符合溶血實驗的規(guī)定。(2)體外細胞毒性實驗：實驗組(0.31±0.02、0.52±0.07、0.77±0.05)和陰性對照組(0.30±0.02、0.53±0.07、0.79±0.10)在24、48和72h的A值均明顯高于陽性對照組(0.19±0.02、0.21±0.03、0.28±0.06,P<0.01)，實驗組與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗組在24、48和72h的RGR(1.01、0.99和0.97)均顯著高于陽性對照組(0.62、0.40和0.36)。

3.新西蘭大白兔股骨頸骨折動物模型的建立和分組：制作12只新西蘭大白兔股骨頸骨折模型，右側(cè)作為實驗側(cè)置入3.5mm載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層螺釘1枚固定，左側(cè)置入3.5mm螺釘作為自身對照側(cè)。術(shù)后12周內(nèi)所有實驗兔活動逐漸恢復正常。切口愈合良好，均于術(shù)后2周拆除切口縫線，無明顯炎性反應、切口裂開及關(guān)節(jié)脫位發(fā)生。

4.髖關(guān)節(jié)X線檢查：術(shù)后12周顯示雙側(cè)股骨頸骨折解剖復位，內(nèi)固定堅強，采用涂層螺釘固定的右側(cè)股骨頸骨折已愈合，采用普通螺釘固定的左側(cè)股骨頸骨折處尚未完全愈合(圖1)。

圖1 術(shù)后12周髖關(guān)節(jié)X線檢查置入復合VEGF和BMP-2涂層螺釘?shù)挠覀?cè)股骨頸骨折愈合，置入普通螺釘固定的左側(cè)股骨頸骨折尚未完全愈合(白色箭頭)

5.micro-CT：實驗側(cè)股骨近端BMD(323.42±43.31mg/mm3)、BV/TV(0.32±0.072)、Tb.Th(0.16±0.074mm)和Tb.N(2.15±0.43/mm)均較對照側(cè)明顯增加(P<0.01)，Tb.Sp(0.30±0.12mm)較對照側(cè)(0.78±0.31mm)降低(P<0.01)，詳見表1。

表1 股骨近端micro-CT檢測

與對照側(cè)比較，*P<0.01

6.組織學分析:術(shù)后12周，涂層螺釘和骨接觸界面多由血管化的新生骨組織構(gòu)成，而非涂層側(cè)鈦合金和骨組織間為纖維組織層。實驗側(cè)釘?shù)乐苓呂⒀茌^對照側(cè)增多稠密。實驗側(cè)股骨近端每×400視野微血管數(shù)目(39.17±14.27)均較對照側(cè)(19.50±6.97)明顯增加(P<0.01)。雙側(cè)均未檢出股骨頭壞死的組織學改變。

圖2 HE染色觀察股骨頸骨折愈合(×400)A.實驗側(cè)釘?shù)乐苓吂切×涸龃衷龆啵⒀苊芏仍黾?；B.對照側(cè)釘?shù)乐車w維組織增生，骨化和微血管密度明顯下降

討 論

股骨頭頸部的滋養(yǎng)動脈主要來自于股骨遠端，股骨頸骨折幾乎等同于將股骨頭頸的血液供應完全切斷，易導致股骨頸骨折不愈合和股骨頭壞死。本研究應用載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層螺釘固定新西蘭大白兔股骨頸骨折，促進骨折端微血管形成，股骨頸和股骨頭內(nèi)骨小梁增粗致密，加速股骨頸骨折愈合。而及早恢復股骨頭的血供，減少股骨頭缺血的時間，是降低股骨頭壞死發(fā)生率的關(guān)鍵[8～10]。

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種特異性促血管內(nèi)皮細胞增生及血管生成因子，對血管再生起著關(guān)鍵性調(diào)控作用[8,9]。本研究也證實涂層螺釘釋放的外源性VEGF顯著增加股骨頸和股骨頭內(nèi)微血管數(shù)量。VEGF誘導的血管生成能增加骨折端血流量，促進軟骨內(nèi)成骨及骨修復，加速骨折愈合；拮抗VEGF作用骨折端完全由纖維組織取代，抑制骨折愈合，X線提示骨折端出現(xiàn)肥大的不連續(xù)骨痂或無骨痂[10]。BMP-2被認為是活性最強的唯一能單獨誘導成骨的因子，促進未分化間充質(zhì)細胞和成骨細胞前體細胞分化為成骨細胞，促進骨缺損修復和骨折愈合[8]。聯(lián)合應用BMP-2與VEGF既能誘導成骨，又能刺激血管再生，使新生的骨組織快速完成血管化[8]。本研究通過PDLLA將VEGF和BMP-2附著于內(nèi)固定螺釘，顯著促進股骨頸和股骨頭內(nèi)骨小梁增粗增多，使股骨頸骨折愈合加快，進一步證實了VEGF和BMP-2在骨折修復中的關(guān)鍵作用。

目前BMP-2或VEGF應用方式主要為附著于固態(tài)人工骨局部置入或液態(tài)載體局部注射于骨折端[11,12]。但目前股骨頸骨折的治療多采用閉合復位技術(shù)，術(shù)中不顯露骨折端，牽引床復位后經(jīng)股骨外側(cè)3～5cm小切口置入直徑6.5mm或7.3mm半螺紋空心釘，經(jīng)長約70～100mm釘?shù)缹晒穷i骨折端進行加壓固定。因此，往往難以將BMP-2或VEGF固態(tài)載體經(jīng)狹長釘?shù)乐萌牍钦蹟喽?，臨床操作困難。有研究者構(gòu)建BMP-2或VEGF可注射性載體并在空心螺釘上靠近骨折端的部位打孔，便于BMP-2和VEGF有效作用于骨折斷端。但此種技術(shù)會導致螺釘力學性能下降，甚至疲勞折斷[13,14]。本研究將BMP-2和VEGF附著于內(nèi)固定螺釘表面，在釘?shù)廊L均勻釋放發(fā)揮生物學作用，增加微血管數(shù)量、骨小梁數(shù)量和厚度，促進股骨頸骨折愈合。

自20世紀60年代以來，以PDLLA為代表的可降解性材料在醫(yī)學界就引起了關(guān)注。由于PDLLA為非晶態(tài)，無遲發(fā)性組織反應，生物相容性好，對骨修復干擾小，且降解吸收時間短，廣泛應用于生物降解醫(yī)用材料領(lǐng)域[15]。本研究中，PDLLA涂層螺釘?shù)娜砑毙远拘詸z測、熱原反應、溶血實驗和體外細胞毒性實驗也證實了其良好的生物相容性。由于PDLLA呈多孔態(tài)結(jié)構(gòu)，有較高的孔隙率且孔隙間相互溝通，是一種具有良好生物相容性的可降解緩釋骨架，也是BMP-2和VEGF的常用控釋載體[16,17]。本研究應用PDLLA負載商品化的具有活性的VEGF和BMP-2，獲得至少12周的VEGF和BMP-2 持續(xù)釋放。李紹良等[18]應用PDLLA負載慶大霉素附著于鈦制克氏針表面進行涂層穩(wěn)定性實驗，證明PDLLA涂層具有較強的機械穩(wěn)定性，在置入髓腔的過程中絕大部分無脫失，并且可以保持PDLLA涂層在內(nèi)固定表面均勻分布。因此，借助PDLLA負載BMP-2和VEGF固著于內(nèi)固定螺釘表面治療股骨頸骨折，并顯著促進了股骨頸骨折愈合，有力證明了PDLLA涂層能夠提供足夠機械穩(wěn)定將VEGF和BMP-2釋放至骨折端發(fā)揮生物學效應，為微血管和新生骨的再生提供良好環(huán)境。

另一方面，空心螺釘采用滑動加壓原理，螺桿提供滑動軸，將應力轉(zhuǎn)化為軸向壓應力，加壓骨折斷端，即使骨折修復過程中發(fā)生骨吸收塊，仍能保持骨折塊間緊密接觸[19]。這一特性在有力保護骨折的愈合環(huán)境的同時，可能導致股骨頸短縮，有研究發(fā)現(xiàn)空心螺釘固定后股骨頸短縮率達30%～42%，降低臨床療效[20,21]。本研究發(fā)現(xiàn)涂層螺釘和骨接觸界面多由血管化的新生骨組織構(gòu)成，而非涂層側(cè)鈦合金和骨組織間為纖維組織層，表明復合VEGF和BMP涂層有助于增加空心螺釘把持力，同時BMP-2和VEGF促進骨修復的生物學效應可能有助于避免骨折斷端骨吸收所致的股骨頸短縮，改善臨床療效。雖然本研究中雙側(cè)均未發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死，但涂層側(cè)股骨近端骨小梁增粗增多致密、骨密度升高、微血管數(shù)量增加，具有抑制股骨頭壞死的作用。

綜上所述，載VEGF和BMP-2的PDLLA涂層生物相容性好，能夠牢固附著于鈦合金螺釘表面，促進股骨近端微血管增生和新生骨形成，加速股骨頸骨折愈合。該涂層制作簡便，生物學效應顯著，在股骨頸骨折治療領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。