L-色氨酸混菌發(fā)酵工藝

張震，熊海波，徐慶陽,2,3*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津，300457)3(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津，300457)

混菌發(fā)酵是指利用兩種或多種微生物的協(xié)同作用共同完成發(fā)酵過程的一種發(fā)酵技術(shù)[1]。混菌發(fā)酵中不同菌種各自的代謝活動具有互補性，并且不會互相抑制生長，表現(xiàn)出互生關(guān)系。這種互補性質(zhì)有時也能獲得純種培養(yǎng)難以達到的良好效果，例如可提高產(chǎn)品產(chǎn)率、獲得特殊代謝產(chǎn)物等[2-3]。目前，混菌發(fā)酵在食品發(fā)酵、廢物處理、酒精生產(chǎn)及環(huán)境改造等領(lǐng)域已有較多應(yīng)用，其他方面的應(yīng)用也在逐漸開展[4]。

L-色氨酸是8種必需氨基酸之一，又被稱為第二必需氨基酸[5]。它能夠調(diào)節(jié)人和動物的新陳代謝和生理功能，改善人和動物的消化功能，并提高其免疫功能，對人和動物的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用[6-7]，因而被廣泛用于飼料和醫(yī)藥行業(yè)。近年來，隨著色氨酸功能的進一步研究，開始在食品、農(nóng)業(yè)與環(huán)境等領(lǐng)域推廣應(yīng)用，市場發(fā)展前景十分廣闊[8]。

微生物直接發(fā)酵法是當(dāng)前L-色氨酸生產(chǎn)的主流方法，該法以葡萄糖等廉價原料為碳源，利用優(yōu)良的色氨酸生產(chǎn)菌種來生產(chǎn)色氨酸，其中大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌應(yīng)用較多[9-10]。但是大腸桿菌在以葡萄糖作為原料生產(chǎn)色氨酸時，會有很大一部分碳源流向乙酸、乳酸等代謝副產(chǎn)物。當(dāng)副產(chǎn)物累積到一定濃度時，菌體生長受到嚴(yán)重抑制，比生長速率迅速下降，從而導(dǎo)致產(chǎn)物合成速率降低，產(chǎn)量下降[11-12]，影響產(chǎn)品質(zhì)量，因此減少乙酸、乳酸等副產(chǎn)物的積累對發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸具有重要意義。谷氨酸棒桿菌能利用乙酸、乳酸等有機酸作為其代謝碳源進行生長[13]且不會對大腸桿菌產(chǎn)生抑制[14]。本研究以無拮抗反應(yīng)的2株色氨酸生產(chǎn)菌大腸桿菌(Escherichiacoli)TRTH和谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum) TQ2223作為混菌發(fā)酵研究對象，構(gòu)建了以大腸桿菌為主、谷氨酸棒桿菌為輔的L-色氨酸混菌發(fā)酵工藝，并采用單因素試驗對混菌發(fā)酵的最佳生產(chǎn)條件進行優(yōu)化，有效地降低了發(fā)酵過程中乙酸、乳酸等代謝副產(chǎn)物的積累，提高了L-色氨酸的產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率，為發(fā)酵法高效生產(chǎn)L-色氨酸提供了新方案。

1 材料與方法

1.1 菌種

L-色氨酸工程菌大腸桿菌TRTH(trpEDCBA+TetR)，L-色氨酸工程菌谷氨酸棒桿菌TQ2223(Phe-+Tyr-)，由天津科技大學(xué)代謝工程研究室提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

大腸桿菌TRTH(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏10，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，瓊脂粉20，四環(huán)素0.05。

谷氨酸棒桿菌TQ2223(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏10，NaCl 2.5，玉米漿粉8，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，瓊脂粉20。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

大腸桿菌TRTH：葡萄糖10 g/L，酵母粉4 g/L，檸檬酸0.5 g/L， (NH4)2SO41 g/L，KH2PO41 g/L，VB11 mg/L，VH0.3 mg/L， MgSO4·7H2O 1.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.8 mg/L，微量元素混合溶液2 mL/L。

谷氨酸棒桿菌TQ2223：葡萄糖20 g/L，酵母粉4 g/L， 豆餅水解液20 mL/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO41 g/L，VB10.3 mg/L，VH0.2 mg/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，Phe 0.1 g/L，Tyr 0.1 g/L。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

混菌發(fā)酵和對照發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L，酵母粉6 g/L，檸檬酸2 g/L，(NH4)2SO44 g/L， KH2PO45 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L， FeSO4·7H2O 75 mg/L，VB15 mg/L，VH0.2 mg/L，微量元素混合溶液4 mL/L。

1.3 儀器與設(shè)備

LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠； 5 L不銹鋼機械攪拌發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；30 L不銹鋼機械攪拌發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；BST-AH智能電加熱蒸汽發(fā)生器，湖北貝思特智能科技有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；TU 1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LC20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；A300氨基酸分析儀，德國安米諾西斯公司。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌種活化

取甘油管中菌種接種于斜面培養(yǎng)基中，傳代活化2次。大腸桿菌TRTH：37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)，每代培養(yǎng)12 h；谷氨酸棒桿菌TQ2223：32 ℃恒溫倒置培養(yǎng)，每代培養(yǎng)24 h。

1.4.2 搖瓶培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：從活化好的斜面上刮取1環(huán)菌體到裝有30 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶(500 mL)中，9層紗布封口。大腸桿菌TRTH：37 ℃，220 r/min培養(yǎng)8～10 h；谷氨酸棒桿菌TQ2223：32 ℃，200 r/min培養(yǎng)12～14 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液按一定接種量接種到裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL容量瓶中，9層紗布封口，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)26～28 h。過程中補加氨水維持pH，補加600 g/L的葡萄糖溶液維持碳源供給。

1.4.3 5 L罐種子培養(yǎng)

利用5 L發(fā)酵罐進行種子培養(yǎng)，初始發(fā)酵液體積定容至3 L。初始通氣量為2 L/min，初始攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min，通過自動流加25%的氨水控制發(fā)酵液pH值在7.0～7.2，TRTH 37 ℃培養(yǎng)，TQ2223 32 ℃培養(yǎng)，通過攪拌和通風(fēng)控制溶氧，TRTH維持在25%～30%，TQ2223維持在15%～30%，以消泡劑消泡。

1.4.4 30 L罐發(fā)酵培養(yǎng)

在最優(yōu)條件下利用30 L發(fā)酵罐進行混菌發(fā)酵培養(yǎng)，初始發(fā)酵液體積定容至15 L，通過自動流加25%的氨水控制培養(yǎng)基pH，通過攪拌和通風(fēng)控制溶氧在25%～40%，通過流加800 g/L的葡萄糖溶液維持發(fā)酵，維持罐內(nèi)糖質(zhì)量濃度≤1 g/L，發(fā)酵過程中，以泡敵消泡，每隔2 h測樣、記錄數(shù)據(jù)。

1.5 試驗方法

1.5.1 菌株拮抗試驗

利用平板擴散對峙法檢測大腸桿菌TRTH和谷氨酸棒桿菌TQ2223菌株間的拮抗反應(yīng)，具體步驟如下：將2種菌分別在斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h之后用無菌水洗脫，制備菌懸液，取2%接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，32或37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，分別取200 μL發(fā)酵液涂布在不同的發(fā)酵培養(yǎng)基平板上，并打孔。隨后將2株菌的發(fā)酵液離心取上清(13 000 r/min、2 min)， 并將1種菌株的上清液100 μL滴加在涂布有另一種菌株的平板孔中，以無菌水做陰性對照，設(shè)置3組平行試驗，置32或37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察有無抑菌圈形成。

1.5.2 單因素試驗

在搖瓶水平上進行單因素實驗，對混菌發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸的最適條件進行初步探究。固定大腸桿菌TRTH接種量(10%)、培養(yǎng)體積(30 mL/500 mL)、搖床轉(zhuǎn)速(220 r/min)及培養(yǎng)時間(26～28 h)，分別考察2種菌的接種間隔時間、谷氨酸棒桿菌TQ2223接種量、pH及培養(yǎng)溫度對OD600值、L-色氨酸產(chǎn)量及乙酸積累量的影響(表1)。

1.5.3 混菌發(fā)酵工藝流程

本工藝采用2個5L發(fā)酵罐(罐A、罐B)和1個30L發(fā)酵罐(罐C)，3罐1組進行雙菌混合發(fā)酵。罐A用于大腸桿菌TRTH種子培養(yǎng)，罐B用于谷氨酸棒桿菌TQ2223種子培養(yǎng)，罐C用于混菌發(fā)酵培養(yǎng)。

罐A、罐B同時開始種子培養(yǎng)，罐A內(nèi)大腸桿菌TRTH種子培養(yǎng)好后先接入已消毒的罐C中，開始發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵至14 h時，再將培養(yǎng)好的罐B內(nèi)谷氨酸棒桿菌TQ2223種子接入罐C中，實現(xiàn)混菌發(fā)酵培養(yǎng)。具體操作要點如下：

表1 培養(yǎng)條件單因素試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of single factor experiment for culture conditions

注：“-”表示無該因素水平。

(1)首先將2株菌種擴培到相應(yīng)的5 L種子罐中進行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基均定容至3 L，大腸桿菌TRTH 37 ℃培養(yǎng)，谷氨酸棒桿菌TQ2223于32 ℃培養(yǎng)，在此期間將罐C空消(121 ℃，20 min)，之后加入發(fā)酵培養(yǎng)基并加水定容至13.5 L后實消(115 ℃，15 min)。

(2)待罐A內(nèi)大腸桿菌TRTH種子液菌體濃度OD600達到10～12時，利用壓差將其按10%接種量(1.5 L)經(jīng)無菌管道接入實消好的罐C中，發(fā)酵培養(yǎng)基最終定容至15 L，維持36 ℃、pH 7.0發(fā)酵培養(yǎng)，同時，罐B內(nèi)谷氨酸棒桿菌TQ2223繼續(xù)維持種子培養(yǎng)。

(3)罐C發(fā)酵開始14 h后，先將發(fā)酵液放出1.1 L，再將罐B內(nèi)培養(yǎng)好的谷氨酸棒桿菌TQ2223種子液利用壓差按7.5%接種量(≈1.1 L)經(jīng)無菌管道接入罐C中，繼續(xù)維持36 ℃、pH 7.0發(fā)酵培養(yǎng)?；炀l(fā)酵工藝流程如圖1所示。

圖1 混菌發(fā)酵工藝流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of mixed bacteria fermentation process

1.6 檢測方法

1.6.1 pH值測定

采用Hamilton pH電極在線檢測，精密試紙(pH 6.4～8.0)輔助檢測。

1.6.2 菌體濃度測定

見參考文獻[15]。

1.6.3L-色氨酸含量測定

見參考文獻[16]。

1.6.4 有機酸副產(chǎn)物含量測定

采用高效液相色譜法檢測有機酸含量。Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm)，流動相5 mmol/L H2SO4，柱溫30 ℃，流速0.5 mL/min，紫外檢測波長215 nm。

1.6.5 氨基酸副產(chǎn)物含量測定

采用A300氨基酸分析儀進行測定。

1.7 分析方法

糖酸轉(zhuǎn)化率根據(jù)公式(1)計算：

糖酸轉(zhuǎn)化率/%=

(1)

式中：發(fā)酵液中L-色氨酸質(zhì)量濃度，g/L；發(fā)酵液總體積，L；總耗糖量，g。

所有試驗數(shù)據(jù)取3次實驗的平均值。單因素方差分析后Dunnett檢驗來確定數(shù)據(jù)差異的顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種拮抗試驗結(jié)果及共生體系的構(gòu)建

平板擴散對峙試驗結(jié)果表明，大腸桿菌TRTH與谷氨酸棒桿菌TQ2223無拮抗反應(yīng)(無抑菌圈形成)，可以進行混菌發(fā)酵(圖2)。

大腸桿菌TRTH是利用基因工程定向改造所得到的L-色氨酸高產(chǎn)菌株，擁有極佳的L-色氨酸生產(chǎn)能力，30 L小試發(fā)酵34 h，產(chǎn)酸可達45 g/L以上[17]，但同時也伴隨有乙酸、乳酸等副產(chǎn)物生成，副產(chǎn)物的大量積累會給發(fā)酵帶來嚴(yán)重的不利影響。而谷氨酸棒桿菌TQ2223雖然L-色氨酸生產(chǎn)能力較弱，同等規(guī)模發(fā)酵72 h，產(chǎn)酸只有10 g/L左右[8]，但它可以快速地吸收和消耗乙酸、乳酸等有機酸作為自身的生長底物。所以，結(jié)合混菌發(fā)酵，通過在大腸桿菌TRTH的發(fā)酵過程中選擇合適的時間加入適當(dāng)量的谷氨酸棒桿菌TQ2223，解決大腸桿菌TRTH單菌發(fā)酵(對照發(fā)酵)的抑制性副產(chǎn)物積累問題是可行的。

A-谷氨酸棒桿菌TQ2223涂布(大腸桿菌TRTH上清點孔); B-大腸桿菌TRTH涂布(谷氨酸棒桿菌TQ2223上清點孔); C-無菌水涂布(無菌水點孔)圖2 平板擴散對峙試驗結(jié)果Fig.2 Results of plate diffusion confrontation test

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1 谷氨酸棒桿菌TQ2223接種量對混菌發(fā)酵的影響

將培養(yǎng)好的大腸桿菌TRTH種子液按10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，在發(fā)酵開始后8 h時分別接入0%、1.25%、2.5%、5%、7.5%、10%的谷氨酸棒桿菌TQ2223種子液，在37 ℃、pH 7.0的條件下，巡回恒溫搖床(220 r/min)培養(yǎng)26 h。發(fā)酵結(jié)束后測定OD600、L-色氨酸產(chǎn)量和乙酸積累量，結(jié)果如圖3。

圖3 谷氨酸棒桿菌TQ2223接種量對混菌發(fā)酵產(chǎn)L-色氨酸的影響Fig.3 Effect of Corynebacterium glutamicum TQ2223 inoculum on L-tryptophan production by mixed fermentation

由圖3可以明顯看出，隨著谷氨酸棒桿菌TQ2223接種量的增加，乙酸積累量大幅減少，并在接種量為10%時達到最低，為0.15 g/L，比最高(接種量為0%)時的2.33 g/L下降了93.6%。同時，OD600和L-色氨酸產(chǎn)量逐漸增加，且L-色氨酸產(chǎn)量在谷氨酸棒桿菌TQ2223接種量為7.5%時達到最高(10.58 g/L)，之后開始下降。分析可知，谷氨酸棒桿菌TQ2223能夠有效地消耗大腸桿菌TRTH在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酸，使得混菌發(fā)酵的乙酸積累量遠低于大腸桿菌TRTH單菌發(fā)酵，菌體活力和整體產(chǎn)酸能力得到提升。谷氨酸棒桿菌TQ2223接種量過小， OD600值和L-色氨酸產(chǎn)量無太大變化，而谷氨酸棒桿菌TQ2223接種量過高會使其過多地占用大腸桿菌TRTH的生長空間，對大腸桿菌的生長產(chǎn)生不利影響，這時雖然乙酸積累量達到最低水平，但是混菌發(fā)酵的整體產(chǎn)酸性能卻開始呈現(xiàn)下降趨勢。因此綜合考慮，選擇7.5% 為谷氨酸棒桿菌TQ2223最佳接種量。

2.2.2 接種間隔時間對混菌發(fā)酵的影響

在最佳谷氨酸棒桿菌TQ2223接種量條件下，分別在發(fā)酵開始后8、10、12、14、16、18 h接入谷氨酸棒桿菌TQ2223種子液，其他培養(yǎng)條件不變，巡回恒溫搖床培養(yǎng)26 h。發(fā)酵結(jié)束后測定OD600、L-色氨酸產(chǎn)量和乙酸積累量，結(jié)果如圖4。

圖4 接種間隔時間對混菌發(fā)酵產(chǎn)L-色氨酸的影響Fig.4 Effect of inoculation interval on L-tryptophan production by mixed fermentation

隨著接種間隔時間的增加，混菌發(fā)酵的乙酸積累量與OD600均無較大變化，且乙酸積累量始終保持在較低水平；L-色氨酸產(chǎn)量先增加，在接種間隔時間為14 h時達到最高，為11.4 g/L，隨后下降。分析可知，接種間隔時間對乙酸最終積累量影響不大，只要在發(fā)酵中接入了谷氨酸棒桿菌TQ2223，乙酸積累都會得到有效控制。另外，大腸桿菌TRTH單菌發(fā)酵一般在10 h左右開始產(chǎn)生副產(chǎn)物乙酸，所以不應(yīng)在發(fā)酵前期進行混菌操作。同時，過晚接入谷氨酸棒桿菌TQ2223又會錯過菌體生長產(chǎn)酸及控制副產(chǎn)物積累的關(guān)鍵時期，導(dǎo)致混菌發(fā)酵效果不佳。綜合考慮，選擇14 h為最佳接種間隔時間。

2.2.3 pH對混菌發(fā)酵的影響

在最佳谷氨酸棒桿菌TQ2223接種量、最佳接種間隔時間條件下，分別于pH值為6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、 7.6環(huán)境中混菌發(fā)酵26 h，其他培養(yǎng)條件不變。發(fā)酵結(jié)束后測定OD600、L-色氨酸產(chǎn)量和乙酸積累量，結(jié)果如圖5。

圖5 pH對混菌發(fā)酵產(chǎn)L-色氨酸的影響Fig.5 Effects of pH value on L-tryptophan production by mixed fermentation

由圖5可知，在pH為6.6～7.6的條件下，混菌發(fā)酵均能生長并維持一定的產(chǎn)酸能力，在pH值為7.0時，混菌發(fā)酵的OD600值及L-色氨酸產(chǎn)量均達到最高，分別為30.56和10.75 g/L；乙酸積累量最低，為0.47 g/L，此時混菌發(fā)酵的菌體活力最為旺盛，產(chǎn)物合成率最高。因此，選擇pH 7.0為混菌發(fā)酵產(chǎn)L-色氨酸的最佳pH。

2.2.4 培養(yǎng)溫度對混菌發(fā)酵的影響

在最佳谷氨酸棒桿菌TQ2223接種量、最佳接種間隔時間和最佳pH條件下，分別于34、35、36、37、38 ℃環(huán)境中混菌發(fā)酵26 h，其他培養(yǎng)條件不變。發(fā)酵結(jié)束后測定OD600、L-色氨酸產(chǎn)量和乙酸積累量，結(jié)果如圖6。

圖6 發(fā)酵溫度對混菌發(fā)酵產(chǎn)L-色氨酸的影響Fig.6 Effects of fermentation temperature on L-tryptophan production by mixed fermentation

由圖6可知，混菌發(fā)酵的乙酸積累量隨著溫度的升高有小幅增長，但總體差異不大。在培養(yǎng)溫度低于36 ℃時，隨著溫度的升高，混菌發(fā)酵的OD600和L-色氨酸產(chǎn)量逐漸增加，且均在36 ℃時達到最高值，分別為32.1和11.82 g/L；當(dāng)培養(yǎng)溫度高于36 ℃時，隨著溫度的升高，混菌發(fā)酵的OD600和L-色氨酸產(chǎn)量均呈下降趨勢。分析可知，在不同的培養(yǎng)溫度下，混菌發(fā)酵的乙酸積累量均維持在較低水平。培養(yǎng)溫度過高或過低都不利于菌體生長和產(chǎn)酸，較低的溫度會使大腸桿菌TRTH的菌體活力受到抑制，菌體生長較為緩慢，導(dǎo)致混菌發(fā)酵體系整體產(chǎn)酸性能下降；較高的培養(yǎng)溫度又會加快菌體衰亡，使菌體活力快速下降，L-色氨酸產(chǎn)量降低。所以綜合考慮，選擇36 ℃為混菌發(fā)酵的最佳溫度。

2.3 混菌發(fā)酵驗證試驗結(jié)果分析

根據(jù)上述試驗所得最佳發(fā)酵條件完善L-色氨酸混菌發(fā)酵工藝，并按照1.5.4所述工藝流程進行3批次平行發(fā)酵驗證，發(fā)酵培養(yǎng)過程檢測OD600、L-色氨酸產(chǎn)量及乙酸積累量，并計算L-色氨酸合成速率及乙酸積累速率，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，在發(fā)酵前14 h，混菌發(fā)酵和對照發(fā)酵的OD600、L-色氨酸產(chǎn)量及乙酸積累量大致相同，此時段二者的L-色氨酸合成速率及乙酸積累速率也無較大差異，這是因為在發(fā)酵前14 h，混菌發(fā)酵還未接入谷氨酸棒桿菌TQ2223，且前期發(fā)酵條件和過程控制與對照發(fā)酵完全相同所致。在發(fā)酵14 h，混菌發(fā)酵接入谷氨酸棒桿菌TQ2223之后，兩種工藝的乙酸積累量首先開始出現(xiàn)較大差異，且隨著發(fā)酵的進行，混菌發(fā)酵的乙酸濃度大幅降低，并始終保持在較低水平。到36 h發(fā)酵結(jié)束時，混菌發(fā)酵的乙酸積累量只有0.87 g/L，較對照發(fā)酵的5.72 g/L降低了84.7%，兩種菌株在乙酸的產(chǎn)生和消耗上形成了一種動態(tài)平衡，并使乙酸積累得到了有效控制。同時，從乙酸積累速率來看(圖7-c)，對照發(fā)酵的乙酸積累速率在14 h開始躍升，并在22 h左右達到峰值(0.55 g/(L·h))，而混菌發(fā)酵及時進行了混菌操作，乙酸被接入的谷氨酸棒桿菌TQ2223迅速消耗，積累速率大幅降低，最低值達到0.19 g/(L·h)，最高值也僅為0.12 g/(L·h)，較對照發(fā)酵的0.55 g/(L·h)，降低了78.2%，乙酸去除效果顯著，乙酸積累給發(fā)酵帶來的負面影響也隨之大幅減弱。

由圖7-a可知，在16 h之后，兩種工藝的OD600值和L-色氨酸產(chǎn)量均開始出現(xiàn)明顯差異，且隨著發(fā)酵的進行，混菌發(fā)酵的優(yōu)勢逐步增大，菌體生長進入穩(wěn)定期以后，混菌發(fā)酵的OD600值維持在100左右，較對照發(fā)酵的93.5提高了6.9%；36 h放罐時，混菌發(fā)酵L-色氨酸產(chǎn)量為52.72 g/L，較對照發(fā)酵的46.43 g/L提高了13.6%。另外，就L-色氨酸合成速率而言(圖7-b)，混菌發(fā)酵表現(xiàn)出較高的單位產(chǎn)酸能力，從而使整體L-色氨酸合成能力高于對照發(fā)酵，最高L-色氨酸合成速率為2.02 g/(L·h)，較對照發(fā)酵的1.82 g/(L·h)提高了11.0%，且在14～32 h的產(chǎn)酸能力均維持較高水平，這有利于色氨酸的大量積累。由表2可知，混菌發(fā)酵的最終糖酸轉(zhuǎn)化率為21.2%，比對照發(fā)酵提高了19.1%，菌體和底物利用率均大幅提高。

a-OD600、L-色氨酸產(chǎn)量和乙酸積累量;b-L-色氨酸合成速率；c-乙酸積累速率圖7 混菌發(fā)酵和對照發(fā)酵產(chǎn)色氨酸過程曲線Fig.7 Time courses of L-tryptophan production mixed fermentation and common fermentation注：A、C、F分別為混菌發(fā)酵的OD600、L-色氨酸產(chǎn)量和乙酸積累量；B、D、E分別為對照發(fā)酵的OD600、L-色氨酸產(chǎn)量和乙酸積累量。

表2 不同發(fā)酵工藝參數(shù)結(jié)果對比Table 2 Comparison of different fermentation process parameters results

注：表中消耗葡萄糖糖總量為已除去所含結(jié)晶水和溶劑水的葡萄糖含量。

在利用大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-色氨酸時產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物中，乙酸對發(fā)酵的影響最大，乙酸會破壞菌體細胞的跨膜質(zhì)子梯度，進而對氧化磷酸化和其他需能跨膜運輸造成抑制。同時，分子態(tài)的乙酸還會通過改變菌體細胞的內(nèi)部pH來擾亂細胞的正常代謝和生理活性[11, 18]。程立坤等[16]利用外源添加試驗證明發(fā)酵液內(nèi)乙酸質(zhì)量濃度高于2 g/L(pH 7.0)時，大腸桿菌TRTH的生長速率、產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率及最高細胞密度均會受到不利影響。而谷氨酸棒桿菌可以快速地吸收和代謝乙酸，其利用體內(nèi)的乙酸激酶在ATP的參與下將乙酸磷酸化為乙酰磷酸，之后乙酰磷酸再由磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的催化下生成乙酰輔酶A，最后乙酰輔酶A進入三羧酸循環(huán)完成乙酸代謝[19-20]。驗證結(jié)果表明混菌發(fā)酵的乙酸積累量始終維持低于1 g/L，遠小于造成菌體抑制的臨界濃度，乙酸對菌體生長和產(chǎn)酸造成的不利影響得以解除，菌體活力旺盛，生物量、糖酸轉(zhuǎn)化率提高，從而使整體產(chǎn)酸能力得到增強，L-色氨酸產(chǎn)量大幅提高。

圖8 混菌發(fā)酵對其他代謝副產(chǎn)物積累的影響Fig.8 Effect of mixed fermentation on accumulation of other by-products

另一方面，由圖8可知，混菌發(fā)酵的副產(chǎn)物乳酸和丙氨酸的積累量也大幅減少，分別由對照發(fā)酵的1.46 和0.95 g/L，降低到0.25 和0.21 g/L。同時，36 h放罐時，發(fā)酵液中未檢測到谷氨酸棒桿菌TQ2223的發(fā)酵副產(chǎn)物異亮氨酸、亮氨酸[21]，這可能是因為異亮氨酸、亮氨酸等副產(chǎn)物被大腸桿菌TRTH完全消耗所致。分析可知，在混菌發(fā)酵過程中，兩種菌株可以相互利用對方產(chǎn)生的發(fā)酵副產(chǎn)物，大腸桿菌TRTH受益于谷氨酸棒桿菌TQ2223的存在，而大腸桿菌TRTH的存在又不會影響谷氨酸棒桿菌TQ2223的生長，二者形成了互利互惠的共生關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究利用2株色氨酸工程菌大腸桿菌TRTH和谷氨酸棒桿菌TQ2223構(gòu)建了以大腸桿菌為主、谷氨酸棒桿菌為輔的L-色氨酸混菌發(fā)酵工藝，并通過單因素試驗確定了混菌發(fā)酵的最佳接種間隔時間14 h，谷氨酸棒桿菌TQ2223接種量7.5%，培養(yǎng)溫度36 ℃，pH 7.0，完善了混菌發(fā)酵工藝。驗證試驗結(jié)果表明，混菌發(fā)酵工藝可以有效降低L-色氨酸發(fā)酵過程中乙酸、乳酸等抑制性副產(chǎn)物的積累量，顯著解除副產(chǎn)物對發(fā)酵的不利影響，大幅提高菌體活力和葡萄糖利用率及L-色氨酸產(chǎn)量。最終，與普通發(fā)酵工藝相比，混菌發(fā)酵工藝的乙酸積累量減少了84.75%，乳酸積累量減少了82.88%，L-色氨酸產(chǎn)量提高了13.6%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了19.1%。