Bmp/Smad 信號通路及其在哺乳動物卵巢發(fā)育中的作用

文禹粱，馬 琳，趙生國，儲明星*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMPs）作為轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）超家族最大的一個亞家族[1]，于1979 年由Urist 等發(fā)現(xiàn)，它們可以使未分化的間充質(zhì)細(xì)胞定向分化為骨細(xì)胞，并鈣化成骨組織，由此得名為骨形態(tài)發(fā)生蛋白[2]。BMPs 在動物體內(nèi)廣泛分布，依靠卵巢功能性的旁分泌/自分泌調(diào)節(jié)體系，對哺乳動物早期胚胎發(fā)育、卵巢顆粒細(xì)胞增殖、生殖激素的合成和分泌以及卵母細(xì)胞成熟起重要調(diào)節(jié)作用，而BMPs 主要依賴于經(jīng)典的Bmp/Smad 信號通路來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[3-5]。本文對Bmp/Smad 信號通路的成員的表達(dá)以及在哺乳動物卵巢發(fā)育中發(fā)揮的功能進(jìn)行總結(jié)，以期為今后更加深入地研究其調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 Bmp/Smad 信號通路

Bmp/Smad 信號通路由細(xì)胞外配體、細(xì)胞表面特異受體以及細(xì)胞內(nèi)SMAD 信號分子三大部分共同構(gòu)成。在Bmp/Smad 信號通路中，在細(xì)胞內(nèi)合成的配體成熟蛋白，以旁分泌/自分泌形式胞吐，再形成同源/異源二聚體，陸續(xù)激活BMPR Ⅱ型、Ⅰ型受體?；罨蘑裥褪荏w將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)R-SMADs 磷酸化，與Co-SMAD 即SMAD4 結(jié)合形成SMAD 蛋白異聚體復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核與靶基因結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[6]。轉(zhuǎn)導(dǎo)過程見圖1。

1.1 Bmp/Smad 信號通路中的配體 Bmp/Smad 信號通路中的配體由許多結(jié)構(gòu)高度保守且功能不同的分泌肽組成，截至目前發(fā)現(xiàn)的有BMP1（mTLD）、BMP2（BMP2A）、BMP3（Osteogenin）、BMP3B（GDF10）、BMP4（BMP2B）、BMP5、BMP6（Vgr1）、BMP7（OP1）、BMP8a（OP2）、BMP8b、BMP9、BMP10、BMP11（GDF11）、BMP12（GDF7，CDMP3）、BMP13（GDF6，CDMP2）、BMP14（GDF5，CDMP1）、BMP15（GDF9B）、BMP16、GDF3（Vgr2）、GDF15（PLAB，PDF） 以及MIS（AMH）等超過25 種成員，除了BMP1，其他成員均屬于TGF-β 超家族[3]（表1）。BMPs 具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在哺乳動物早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)的合成以及調(diào)控綿羊排卵數(shù)以及產(chǎn)羔數(shù)等方面發(fā)揮著重要作用[8-10]。

圖1 Bmp/Smad 信號通路[7]

表1 Bmp/Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的配體、受體以及SMAD 信號分子[11-14]

1.2 Bmp/Smad 信號通路中的受體 BMP 受體（Bone Morphogenetic Protein Receptor，BMPR）為膜蛋白受體，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，屬于TGF-β 超家族成員。截至目前為止共發(fā)現(xiàn)I 型和II 型2 種BMP 受體。I 型受體包括ActR I A（ALK2）、BMPR I A（ALK3）以及BMPR I B（ALK6），II 型受體包括BMPR II、ActR II A 以及ActR II B（表1）。I 型和II 型受體分別為55 ku 和70 ku 的糖蛋白，它們的胞外區(qū)域含有約150 個氨基酸，I 型受體具有獨特的GS（富含甘氨酸和絲氨酸的序列）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有序列SGSGS，位于激酶結(jié)構(gòu)域之前30 個氨基酸的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。在Bmp/Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，BMPs 特異性配體和II 型受體結(jié)合形成配體-II 型受體復(fù)合物，再與I 型受體結(jié)合形成異型低聚體復(fù)合物。這時I 型受體高度保守的N端富含絲氨酸/蘇氨酸的激酶區(qū)被II 型受體的激酶作用發(fā)生磷酸化后被活化[15]。

1.3 Bmp/Smad 信號通路中的Smad 信號分子 在I 型受體活化后可捕獲R-SMADs，使R-SMADs C 末端磷酸化，導(dǎo)致R-SMADs 被SMAD4 上袋狀結(jié)構(gòu)識別并進(jìn)入細(xì)胞核與DNA 結(jié)合而識別目的基因發(fā)揮生物活性[16]。SMADs 蛋白在Bmp/Smad 信號通路起著重要銜接作用，由約500 個氨基酸殘基組成[17]。1995年，在果蠅中首次發(fā)現(xiàn)BMP 同源物（dpp）的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，Raftery 和Sekelsky 將它們分別命名為Mad和Medea[18-19]。1996 年，線蟲II 型受體Daf-4 所識別的SMA/2/3/4 被Savage 等[20]克隆出來。由 于Mad、Sma 以及其他隨后發(fā)現(xiàn)的具有獨特的N 和C 端結(jié)構(gòu)域同源物均為TGF-β 超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需，所以SMA 和MAD 2 個單詞被Derynck 等[21]結(jié)合命名為SMAD。迄今為止已發(fā)現(xiàn)9 種脊椎動物SMAD 蛋白，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能特點分為3 類：①受體激活型SMAD蛋白（Receptor Activated Smads，R-SMADs），包括SMAD1/2/3/5/8/9，它們是I 型受體激酶的底物，具有通路特異性，其中SMAD1/5/8 受BMP I 型受體的激活；SMAD2/3 受TGF-β 和activin II 型受體的激活。②通用調(diào)節(jié)性SMAD 蛋白（Common Mediator Smad，Co-SMAD），它通過與R-SMADs 的結(jié)合形成異源復(fù)合物，隨后移位入核參與信號傳遞，在哺乳動物中Co-SMAD只有1 種，即SMAD4[22]。③抑制型SMAD 蛋白（Inhibitory Smads，I-SMADs），包括SMAD6 和SMAD7。它們以不同方式抑制Smads 的信號傳導(dǎo)功能[23]。

2 Bmp/Smad 信號通路配體、受體以及SMAD 信號分子的表達(dá)及其在卵巢發(fā)育中的作用

2.1 Bmp/Smad 信號通路中配體的表達(dá)以及在卵巢發(fā)育中的作用 自發(fā)現(xiàn)BMP 家族成員在卵巢細(xì)胞中表達(dá)以來，越來越多的研究證實了Bmp/Smad 信號通路在哺乳動物生殖活動中的重要性[24]。在綿羊卵巢中，Canty-Laird 等[10]利用免疫組化的方法對BMP1 進(jìn)行定位，結(jié)果顯示，BMP1 存在卵泡發(fā)育所有階段的顆粒細(xì)胞中，并且調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的形成。Erickson 等[25]在小鼠卵巢原發(fā)性、繼發(fā)性以及竇狀卵泡顆粒細(xì)胞中檢測到了BMP2 mRNA 的表達(dá)。在人卵丘細(xì)胞中，Demiray等[26]檢測到BMP2 mRNA 的表達(dá)，并認(rèn)為BMP2 的表達(dá)可作為檢測卵母細(xì)胞以及胚胎質(zhì)量的指標(biāo)。Ying等[27]研究認(rèn)為，內(nèi)胚層衍生物BMP2 和外胚層衍生物BMP4 協(xié)作可刺激小鼠原始生殖細(xì)胞（Primordial Germ Cells，PGCs）生成。

1999 年，Shimasaki 等[28]認(rèn)為BMP4 是格拉夫卵泡發(fā)育中的黃體化抑制因子。研究表明，BMP4 為綿羊生殖所必需，具有調(diào)節(jié)動物卵泡的發(fā)育、促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、卵丘擴(kuò)散以及促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟和排卵等功能[29]。Tan 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，BMP4 可促進(jìn)卵泡發(fā)育，在小鼠體內(nèi)或者體外添加都可以促進(jìn)初級卵泡轉(zhuǎn)化為次級卵泡。又有研究表明，BMP4 基因可誘導(dǎo)增加顆粒細(xì)胞對促卵泡激素（FSH）敏感性，調(diào)控FSH 依賴的雌激素和孕酮合成[28]。本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)[30]，小尾寒羊BMP4 基因外顯子3 第305 位堿基發(fā)生C/A 突變，該突變的BB 型小尾寒羊平均產(chǎn)羔數(shù)比AB 型和AA 型多0.61 只，與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)呈加性效應(yīng)。在大鼠卵巢中，Pierrer 等[31]通過原位雜交方法對BMP5 的表達(dá)模式進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)BMP5 主要表達(dá)于小型至大型竇狀卵泡的顆粒細(xì)胞以及卵丘細(xì)胞中，并且BMP5 對孕酮生成有明顯的劑量依賴性抑制作用。BMP6 mRNA 在小鼠、綿羊、牛以及山羊卵母細(xì)胞中表達(dá)[25-32]。Lee 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，BMP7 可促進(jìn)原始卵泡的募集，并且BMP7 抑制孕酮的產(chǎn)生可能與排卵機(jī)制相關(guān)，另外BMP7 在小鼠體內(nèi)或體外添加均有利于雌二醇增加[34]。BMP15 又稱為GDF9B，已經(jīng)被確定為影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因，其在綿羊、小鼠、人以及牛的卵子發(fā)生和卵泡發(fā)育過程中扮演著重要的角色[36-39]。研究表明，BMP15 對動物卵泡發(fā)育、卵巢顆粒細(xì)胞的增殖、卵丘的擴(kuò)展、卵母細(xì)胞的成熟和排卵等方面均發(fā)揮著重要調(diào)控作用[29,38-40]。Zhai 等[41]在豬卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體體外實驗中發(fā)現(xiàn)，添加BMP15 可抑制卵丘細(xì)胞凋亡。Muralidharan 等[42]在水牛卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體體外培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，BMP15 的表達(dá)與卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散程度密切相關(guān)。但是BMP15 在不同物種中的表達(dá)模式可能存在差異，Passos 等[38]在牛腔前卵泡體外培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，添加BMP15 可上調(diào)FSHR 的表達(dá)。但是Otsuka 等[43]在體外培養(yǎng)大鼠顆粒細(xì)胞實驗中發(fā)現(xiàn)，BMP15 可降低FSH 對顆粒細(xì)胞的刺激作用，延長細(xì)胞黃體化時間。關(guān)于其具體的表達(dá)模式需要進(jìn)一步的研究證實。

2.2 Bmp/Smad 信號通路中受體以及SMAD 信號分子的表達(dá)及其在卵巢發(fā)育中的作用 在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，BMPs 必須與配體相結(jié)合形成異型低聚體復(fù)合物，再與下游SMAD 信號分子結(jié)合才可發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。1982年，Davis 等在高繁殖力布魯拉美利奴羊中發(fā)現(xiàn)，常染色體的某個基因突變后會導(dǎo)致母羊的高排卵數(shù)性狀出現(xiàn)，該基因增加1 個拷貝突變將導(dǎo)致母羊排卵數(shù)增加1.65 個[44]。1989 年，綿羊和山羊遺傳學(xué)命名委員會將調(diào)控布魯拉美利奴羊排卵數(shù)性狀的基因命名為FecB（Fecundity Booroola）基 因[45]。2001 年，F(xiàn)ecB 基 因突變被定位在BMPR1B 基因上，并認(rèn)為BMPR1B 基因編碼區(qū)發(fā)生了A746G 的突變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)序列中的第249 位的谷氨酰胺被置換為精氨酸（Q249R）[46]。BMPR1B 為BMP 的I 型受體，其突變后增加了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程對下游受體的信號強(qiáng)度，導(dǎo)致卵泡早熟，排卵數(shù)增加[45]。已有研究表明，BMP I 型以及II 型受體在小鼠、牛以及綿羊卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中表達(dá)[46-48]。在人體顆粒細(xì)胞中亦可檢測到BMPRIA、BMPRIB 以及BMPRII[49]。在山羊卵巢中，Costa 等[50]測得BMPRIB以及BMPR II 的mRNA 表達(dá)水平在0.2 mm 的卵泡中高于1.0 mm 的卵泡。

SMAD 蛋白是將BMPs 配體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的介導(dǎo)蛋白。Jessica 等[51]利用可識別磷酸化R-SMADs 的抗體監(jiān)測其信號傳導(dǎo)過程發(fā)現(xiàn)，R-SMADs 以高度保守的方式存在于所有物種的信號傳遞途徑中。SMAD1/5/8 為Bmp/Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受體激活型蛋白，它們與活化的I 型受體結(jié)合，被磷酸化后與SMAD4 結(jié)合轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核，使BMPs 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。在PGCs 分化期間，磷酸化的SMAD1/5/8 蛋白被定位在從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)的過程中。Okamura 等[52]在小鼠PGCs 體外培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，SMAD1/5 為BMP4 內(nèi)信號因子，刺激PGCs外胚層的發(fā)育，SMAD1 和SMAD5 的協(xié)同表達(dá)可刺激BMP4 在E5.25～5.5 時PGCs 外胚層的發(fā)育。Hayashi 等[53]研究發(fā)現(xiàn)，SMAD1 基因缺陷的小鼠在E10.5～11.5 時由于器官發(fā)育不全而死亡。又有研究表明，SMAD1 基因缺失的小鼠同樣由于器官發(fā)育不全而死亡[8]。這說明二者對于PGCs 的發(fā)育過程中起到關(guān)鍵作用。SMAD4 作為哺乳動物唯一的通用調(diào)節(jié)型蛋白，是哺乳動物卵泡發(fā)育以及排卵所必需[54]，同時SMAD4 可促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞成熟分化，通過調(diào)節(jié)FSH 以及促黃體生成素（LH）的水平對卵巢功能進(jìn)行調(diào)控[55]。Sirard 等[56]研究發(fā)現(xiàn)，與所有BMP 受體基因敲除的小鼠一樣SMAD4 基因缺失的小鼠內(nèi)臟器官不能正常發(fā)育而死亡，這說明SMAD4 作為通用型蛋白在Bmp/Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要性。作為抑制型SMAD 蛋白，SMAD6 和SMAD7 通過不同的方式阻止或者干擾信號通路信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在哺乳動物中，SMAD6 可特異阻斷Bmp/Smad1 途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但是不干擾SMAD1 的磷酸化，從而與SMAD4 競爭結(jié)合受體激活的SMAD1，產(chǎn)生無活性的SMAD1-SMAD6復(fù)合物，從而阻止信號的傳遞[57]。而SMAD7 主要抑制TGF-β 信號傳導(dǎo)。Nakao 等[58]在非洲爪蟾胚胎研究中發(fā)現(xiàn)，SMAD7 的轉(zhuǎn)染可抑制SMAD2 和SMAD3 的磷酸化，從而阻斷TGF-β 通路信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

3 總結(jié)與展望

BMPs 發(fā)現(xiàn)至今已有39 年歷史，關(guān)于該家族成員的功能研究已有大量報道。無論是基因敲除、PGCs 體外培養(yǎng)、卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)實驗，均表明BMPs 以及Bmp/Smad 信號通路在哺乳動物PGCs 的形成、卵巢顆粒細(xì)胞的增殖、卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟以及生殖激素的合成和分泌等方面均發(fā)揮著重要作用。

世界養(yǎng)羊業(yè)共同追求的高繁殖力目標(biāo)是羊的多羔性狀。在綿羊上進(jìn)行高繁殖力影響因素的研究具有十分重要的意義，而Bmp/Smad 信號通路顯著影響哺乳動物的繁殖性能，但這些基因的作用機(jī)理等方面研究還不夠深入。相信隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，在Bmp/Smad信號通路中會發(fā)現(xiàn)更多影響綿羊多羔性狀的主效基因和候選基因，并對它們加以利用，以更好地促進(jìn)養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展。