花椒麻味物質(zhì)分子印跡預(yù)組裝體系的分子模擬與吸附性能

陳曉龍 李 耀 闞建全，2*

（1西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 重慶 400715

2重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶 400715）

分子印跡聚合物（MIPs）是指模擬自然界所存在的分子識(shí)別作用機(jī)理，如酶與底物、抗體與抗原等的特異性識(shí)別，以目標(biāo)分子為模板，將具有結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的聚合物功能單體通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵方式與模板分子結(jié)合，再加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑進(jìn)行聚合和交聯(lián)，反應(yīng)結(jié)束后將模板分子洗脫而形成的能識(shí)別模板分子空穴的一類(lèi)高分子聚合物[1-3]。MIPs具有構(gòu)效預(yù)定性、選擇識(shí)別性和廣泛實(shí)用性等特點(diǎn)，在處理環(huán)境污染物、分離手性藥物、分離檢測(cè)食品中痕量物質(zhì)等方面有著十分廣泛的應(yīng)用[4-8]。它的合成受模板分子、功能單體的種類(lèi)、模板分子與功能單體的比例、溶劑、交聯(lián)劑以及聚合條件等因素的影響[9-11]。目前，對(duì)分子印跡聚合物中功能單體、溶劑的選擇主要是根據(jù)以往的經(jīng)驗(yàn)或相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行，具有一定的盲目性，缺少理論指導(dǎo)[12]。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)及量子化學(xué)理論的發(fā)展，計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)逐漸應(yīng)用到分子印跡體系的研究中，在解釋分子聚合物識(shí)別機(jī)理[13]，篩選功能單體[14-16]，確定模板分子與功能單體的最佳比例[17]以及選擇合適的溶劑等[18]方面發(fā)揮作用，可以減少試驗(yàn)工作量，縮短試驗(yàn)周期。

花椒麻味物質(zhì)是花椒中一類(lèi)具有麻味的鏈狀不飽和脂肪酰胺類(lèi)物質(zhì)，主要成分是（羥基）-α-山椒素、（羥基）-β-山椒素、（羥基）-γ-山椒素等，是一類(lèi)“蝌蚪型”少結(jié)合位點(diǎn)物質(zhì)，其具有麻醉、興奮、殺蟲(chóng)、抑菌、祛風(fēng)除濕和鎮(zhèn)痛等功效[19-22]。目前，對(duì)花椒麻味物質(zhì)的分離提取方法主要有水提法[23]、有機(jī)溶劑提取法[24-26]、超臨界 CO2萃取法[27，28]，這些方法雖能較好地提取花椒麻味物質(zhì)，但其提取的步驟繁瑣，提出物雜質(zhì)含量較高，且未對(duì)花椒麻味物質(zhì)進(jìn)行純化。尋找一種新的花椒麻味物質(zhì)分離純化方法制備對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)具有十分重要的意義。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，花椒麻味物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有較多的雙鍵，如果直接作為模板分子，則會(huì)與功能單體發(fā)生反應(yīng)，使得麻味物質(zhì)難以洗脫。為了克服麻味物質(zhì)難以洗脫的困難，采用作者合成的花椒麻味類(lèi)似物作為模板分子，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 花椒麻味類(lèi)似物Fig.1 The analogue of numb-taste components

本文運(yùn)用Gaussian03W中的PM3與Hartree-Fock法篩選出可用于制備花椒麻味類(lèi)似物分子印跡聚合的功能單體、致孔劑以及模板分子與功能單體的物質(zhì)的量比。在此基礎(chǔ)上，選擇3種功能單體和3種致孔劑以表面分子印跡法合成印跡聚合物，通過(guò)評(píng)價(jià)聚合物的動(dòng)態(tài)吸附與靜態(tài)吸附能力來(lái)驗(yàn)證計(jì)算機(jī)分子模擬的效果，以期為快速制備分子印跡聚合物提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒麻味類(lèi)似物物結(jié)晶體，自制，純度95%，相對(duì)分子質(zhì)量271；硅膠（120～160目），青島海洋化工有限公司；鹽酸、乙酸、無(wú)水甲苯、丙酮、甲醇均為分析級(jí)級(jí)，成都市科龍化工試劑廠；甲基丙烯酸（MAA），Sigma 公司；EDMA，成都市科龍化工試劑廠；甲基亞氨基二乙酸，成都市科龍化工試劑廠；乙烯基苯甲酸，成都市科龍化工試劑廠；偶氮二異丁腈（AIBN），成都市科龍化工試劑廠；r-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（KH-570），南京創(chuàng)世化工助劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

真空干燥箱DZF-6020，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；氮吹儀UGC-12C，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；磁力攪拌器，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀Agilent1200，德國(guó)。計(jì)算機(jī)模擬平臺(tái)：DALL電腦，2.00G的內(nèi)存，500G硬盤(pán)，Windows操作系統(tǒng)；Gaussian 03W、Gaussian view軟件。

1.3 原理和方法

1.3.1 計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)

1.3.1.1 功能單體的篩選 以花椒麻味類(lèi)似物為模板分子，選擇常見(jiàn)制備分子印跡聚合物的功能單體甲基丙烯酸（MAA）、丙烯酸（AA）、三氟甲基丙烯酸（TFMAA）、乙烯基苯甲酸、丙烯酰胺（MA）、1-乙烯基咪哚、2-甲基-1-乙烯基咪哚、2-吡啶（2-VPy）、4-吡啶（4-VPy）、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基亞氨基二乙酸、N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）、亞氨基二乙酸，運(yùn)用Gaussian 03W中的PM3法優(yōu)化篩選出功能單體，得出模板分子與功能單體的最低能量構(gòu)象圖及各原子上的Mulliken電荷，找出模板分子與功能單體的質(zhì)子結(jié)合點(diǎn)與給出點(diǎn)。以式（1）計(jì)算模板分子與各功能單體的結(jié)合能△E，結(jié)合能越大表示模板分子與該功能單體相互作用越強(qiáng)，所形成的MIPs穩(wěn)定性越好[29-31]。

式中：E（聚合物）——模板分子-功能單體聚合物單點(diǎn)能，kJ·mol-1；n——功能單體數(shù)量；E（功能單體）——功能單體單點(diǎn)能，kJ·mol-1；E（模板）——模板分子單點(diǎn)能，kJ·mol-1。

1.3.1.2 模板分子與功能單體比例的確定 根據(jù)1.3.1.節(jié)優(yōu)選出的功能單體，模擬模板分子與功能單體可能的結(jié)合情況，得出模板分子與功能單體理論上的物質(zhì)的量比，再根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定模板分子與功能單體實(shí)際的物質(zhì)的量比。

1.3.1.3 致孔劑的篩選 選取乙腈、氯仿、四氯化碳、甲醇4種具有代表性的致孔劑，采用Hartree-Fock方法，6-31G+（d）基組，極化連續(xù)溶劑模型（Polarizable continuum model，PCM），按 式 （2）計(jì)算溶劑化能。溶劑化能越小表明該溶劑對(duì)模板分子與功能單體的作用力越小，越適合用作體系的致孔劑[32-33]。

式中：ΔE（溶劑）——體系的溶劑化能，kJ·mol-1；E（PCM）——溶劑狀態(tài)下體系的單點(diǎn)能，kJ·mol-1；E（HF）——?dú)鈶B(tài)狀況下體系的單點(diǎn)能，kJ·mol-1。

1.3.2 MIPs、NIPs的制備 在計(jì)算機(jī)分子模擬結(jié)果的基礎(chǔ)上，優(yōu)選的3種功能單體與3種溶劑采用表面分子印跡的方法制備MIPs、NIPs，分別記為 MIP1、MIP2、MIP3、MIP4、MIP5、MIP6和 NIP1、NIP2、NIP3、NIP4、NIP5、NIP6。

1）硅膠活化與硅烷化 取硅膠10 g，先用10%的鹽酸回流12 h，除去硅膠中少量的無(wú)機(jī)雜質(zhì)并增加硅膠表面的羥基數(shù)目。用蒸餾水洗至中性，60℃真空干燥，備用[34-35]。

N2保護(hù)條件下，將10 g活化硅膠以及100 mL無(wú)水甲苯加入250 mL圓底燒瓶中，在磁力攪拌條件下加入KH-570硅烷偶聯(lián)劑10 mL，于80℃條件下回流反應(yīng)24 h，將反應(yīng)后的硅膠過(guò)濾，制得表面被不飽和C＝C雙健修飾的改性硅膠。將所得產(chǎn)物依次用甲苯、丙酮、甲醇洗滌，于100℃條件下干燥12 h，得到硅烷化硅膠[34-36]。

2） MIP1、MIP2、MIP3的制備 取 271 mg（約 1 mmol）花椒麻味類(lèi)似物分散于50 mL乙腈中，在攪拌條件下加入4 mmol甲基亞氨基二乙酸（乙烯基苯甲酸、MAA）、16 mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）和1.5 g表面修飾的活化硅膠，超聲30 min使其充分分散，最后加入30 mg偶氮二異丁睛，N2鼓泡出氧5 min，放入水浴磁力攪拌鍋中，在60℃、N2保護(hù)下聚合反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，將反應(yīng)物抽濾，60℃真空干燥10 h后，用甲醇-乙酸（9∶1，V/V）索氏抽提 18 h。 最后用甲醇抽提 18 h，以徹底除去乙酸和模板分子，制得MIP1（MIP2、MIP3）。 NIP1、NIP2、NIP3的制備過(guò)程與上述方法類(lèi)似，只是在制備過(guò)程中不加入花椒麻味類(lèi)似物[37]。

3） MIP4、MIP5、MIP6的制備 MIP4、MIP5、MIP6的制備過(guò)程與2）類(lèi)似，只是在制備過(guò)程中將功能單體確定為甲基亞氨基二乙酸，變化致孔劑為乙腈、甲醇、氯仿。NIP4、NIP5、NIP6的制備過(guò)程與上述方法類(lèi)似，只是在制備過(guò)程中不加入花椒麻味類(lèi)似物。

1.3.3 聚合物的動(dòng)態(tài)吸附性考察 準(zhǔn)確稱(chēng)取20 mg MIPs及NIPs于10 mL離心管中，加入200 μg/mL花椒麻味物質(zhì)5 mL，恒溫（20℃）水浴振蕩0.5，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5 h，同時(shí)以空白為對(duì)照。吸附一段時(shí)間后，3 000 r/min離心10 min，吸取上層清液，用0.22 μm濾頭過(guò)濾后高效液相色譜測(cè)定其濃度，平行3次，按式（3）計(jì)算其對(duì)花椒麻味物質(zhì)的吸附容量Q（μg/mg），并繪制吸附容量一時(shí)間關(guān)系曲線，以此來(lái)考察分子印跡聚合物對(duì)花椒麻味物質(zhì)的結(jié)合速度，確定吸附達(dá)到平衡的時(shí)間[38]。

式中：C0——花椒麻味物質(zhì)的初始質(zhì)量濃度（μg/mL）；Ct——上層清液中花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量濃度 （μg/mL）；V——所取花椒麻味物質(zhì)溶液的體積（mL）；m——聚合物的質(zhì)量（mg）。

高效液相色譜分析條件：采用Agilent高效液相色譜儀，色譜柱Zorbax XDB C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相 A：40%超純水；流動(dòng)相 B：60%甲醇；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm[26]。

1.3.4 聚合物的靜態(tài)吸附性研究 準(zhǔn)確稱(chēng)取20 mg MIPs及NIPs于10 mL離心管中，加入25，50，100，150，200，250 μg/mL花椒麻味物質(zhì)溶液5 mL，恒溫（20℃）水浴振蕩 4.5 h后，3 000 r/min離心10 min，吸取上層清液，用0.22 μm濾頭過(guò)濾后高效液相色譜測(cè)定其濃度，平行3次，按式（3）計(jì)算花椒麻味物質(zhì)的吸附量Q（μg/mg），并繪制吸附容量-濃度關(guān)系曲線[38]。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法

采用Origin 8.0、Microsoft excel 2007軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有試驗(yàn)平行重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 計(jì)算機(jī)分子模擬的試驗(yàn)

2.1.1 功能單體的篩選 用Gaussian 03W 中的PM3法優(yōu)化模板分子與功能單體。優(yōu)化后花椒麻味類(lèi)似物與各功能單體的主要質(zhì)子給出點(diǎn)和結(jié)合點(diǎn)見(jiàn)表1。

原子所帶負(fù)電荷越大，接受質(zhì)子的能力越強(qiáng)；所帶正電荷越大，給出質(zhì)子的能力越強(qiáng)[39]?；ń仿槲额?lèi)似物既能接受質(zhì)子，也能給出質(zhì)子；功能單體AM、甲基丙烯酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）雖存在很好的質(zhì)子結(jié)合點(diǎn)，但其質(zhì)子給出點(diǎn)電荷小，給質(zhì)子能力弱；1-乙烯基咪哚、2-甲基-1-乙烯基咪哚、2-VPy、4-VPy質(zhì)子接合點(diǎn)、給出點(diǎn)電荷均較小，與花椒麻味類(lèi)似物結(jié)合穩(wěn)定性低。初選出功能單體AA、TFMAA、MAA、乙烯基苯甲酸、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基亞氨基乙二酸、亞氨基乙二酸。

在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用gaussian 03W中的PM3法將優(yōu)選出的花椒麻味類(lèi)似物與功能單體按照1∶2的比例進(jìn)行結(jié)合物最低能量結(jié)構(gòu)優(yōu)化 （見(jiàn)圖2），根據(jù)式（1）計(jì)算結(jié)合能（見(jiàn)表2）。

分子印跡預(yù)聚合過(guò)程中形成聚合物的相互作用能ΔE（即結(jié)合能）越高，模板分子與功能單體在預(yù)聚合時(shí)形成的聚合物越穩(wěn)定[29-31]。對(duì)于同一模板分子來(lái)說(shuō)，與該功能單體的結(jié)合能越高印跡效果越佳。由表3可看出，ΔE（花椒麻味類(lèi)似物-甲基亞氨基二乙酸）＞ΔE（花椒麻味類(lèi)似物-乙烯基苯甲酸）＞ΔE（花椒麻味類(lèi)似物-亞氨基二乙酸）＞ΔE（花椒麻味類(lèi)似物-MAA）＞ΔE （花椒麻味類(lèi)似物-AA）＞ΔE（花椒麻味類(lèi)似物-TFMAA）＞ΔE（花椒麻味類(lèi)似物-甲基丙烯酸羥乙酯），說(shuō)明甲基亞氨基二乙酸與花椒麻味類(lèi)似物形成的聚合物最穩(wěn)定，乙烯基苯甲酸次之，甲基丙烯酸羥乙酯最差。后續(xù)試驗(yàn)選擇甲基亞氨基二乙酸（功能單體1）、乙烯基苯甲酸（功能單體2）、MAA（功能單體3）作為分子印跡的功能單體制備相應(yīng)的MIPs。

表1 花椒麻味類(lèi)似物與各功能單體的主要質(zhì)子給出點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)Table1 The main proton give point and combine point of the functional monomer and numb-taste components analogue

圖2 花椒麻味類(lèi)似物與功能單體的模擬優(yōu)化結(jié)合圖Fig.2 Combination chart of the numb-taste components analogue and functional monomer

表2 花椒麻味類(lèi)似物與功能單體的模擬結(jié)合能表Table2 Binding energy meter of the numb-taste components analogue and functional monomer

2.1.2 模擬確定的模板分子與功能單體比例 功能單體為MIPs提供特定的結(jié)合位點(diǎn)，其添加量少，會(huì)導(dǎo)致MIPs的專(zhuān)一識(shí)別位點(diǎn)少，印跡空穴少；其添加量過(guò)多，則會(huì)引入更多的游離功能基團(tuán)，導(dǎo)致特異性吸附位點(diǎn)減少，非特異性吸附位點(diǎn)增多[40]?；ń仿槲额?lèi)似物作為模板分子時(shí)，其O19，電荷為-0.366，H44，電荷為 0.194，是很好的質(zhì)子結(jié)合點(diǎn)與給出點(diǎn)。理論上花椒麻味類(lèi)似物與功能單體甲基亞氨基二乙酸、MAA、乙烯基苯甲酸按1∶2的比例反應(yīng)，然而考慮到實(shí)際情況中甲基亞氨基二乙酸等不能完全與花椒麻味類(lèi)似物反應(yīng)，確定花椒麻味類(lèi)似物與功能單體的比例為1∶4[39]。

2.1.3 致孔劑的模擬篩選 利用式（2）計(jì)算體系的溶劑化能，見(jiàn)表3、表4。ΔE（甲基亞氨基二乙酸-乙腈）＜ΔE（甲基亞氨基二乙酸-甲醇）＜ΔE（甲基亞氨基二乙酸-氯仿）＜ΔE（甲基亞氨基二乙酸-四氯化碳）；ΔE（花椒麻味類(lèi)似物-乙腈）＜ΔE（花椒麻味類(lèi)似物-甲醇）＜ΔE（花椒麻味類(lèi)似物-氯仿）＜ΔE（花椒麻味類(lèi)似物-四氯化碳）。模板分子與功能單體在致孔劑乙腈中的溶劑化能最小，說(shuō)明乙腈與花椒麻味類(lèi)似物和功能單體的相互作用力小，適合于該分子印跡體系；甲醇次之，四氯化碳最差。后續(xù)試驗(yàn)選擇乙腈（致孔劑1）、甲醇（致孔劑2）、氯仿（致孔劑3）作為分子印跡的致孔劑制備相應(yīng)的MIPs。

2.2 實(shí)際分子印跡聚合物的動(dòng)態(tài)、靜態(tài)吸附性

2.2.1 不同功能單體制備的MIPs動(dòng)態(tài)、靜態(tài)吸附性 對(duì)3種功能單體制備的MIPs進(jìn)行動(dòng)態(tài)、靜態(tài)吸附性考察 （圖3），發(fā)現(xiàn)不同功能單體制成的MIPs的飽和吸附容量及平衡吸附時(shí)間不同。在200 μg/mL的花椒麻味物質(zhì)溶液中，MIP1的平衡吸附時(shí)間為 4.5 h，飽和吸附容量Q（MIP1）=27.62μg/mg；MIP2、MIP3的平衡吸附時(shí)間為 5.5 h，飽和吸 附 容 量 Q（MIP2）=22.19 μg/mg，Q（MIP3）=19.43 μg/mg。 相對(duì)于 MIP2、MIP3來(lái)說(shuō)，MIP1達(dá)到平衡吸附的時(shí)間更快，飽和吸附容量更大，這是由于甲基亞氨基二乙酸結(jié)合質(zhì)子，給出質(zhì)子的能力強(qiáng)，能迅速與花椒麻味物質(zhì)發(fā)生氫鍵結(jié)合，形成穩(wěn)定的印跡聚合物。由圖3b可知，MIP1在花椒麻味物質(zhì)溶液質(zhì)量濃度大于200 μg/mL時(shí)，聚合物達(dá)到飽和吸附，而MIP2、MIP3在溶液質(zhì)量濃度低于200 μg/mL 時(shí)就達(dá)到飽和吸附，且 Q （MIP1）＞Q（MIP2）＞Q（MIP3），說(shuō)明 MIP1的印跡結(jié)合位點(diǎn)多，能更多地吸附花椒麻味物質(zhì)，與計(jì)算機(jī)分子模擬結(jié)果相符。

表3 不同溶劑下甲基亞氨基二乙酸的溶劑化能Table3 The solvent energy of N-（carboxymethyl）-Glycine in different solvents

表4 不同溶劑下花椒麻味類(lèi)似物的溶劑化能Table4 The solvent energy of the numb-taste components analogue in different solvents

以上結(jié)果說(shuō)明，運(yùn)用計(jì)算機(jī)分子模擬中的PM3法來(lái)優(yōu)化花椒麻味類(lèi)似物與功能單體的分子結(jié)構(gòu)，通過(guò)Mulliken電荷及結(jié)合能來(lái)篩選功能單體具有實(shí)用性。

圖3 不同功能單體的MIPs動(dòng)態(tài)、靜態(tài)結(jié)合曲線Fig.3 Dynamic binding and static binding curves of MIPs with different functional monomers

2.2.2 不同致孔劑制備的MIPs動(dòng)態(tài)、靜態(tài)吸附性 不同致孔劑下合成的MIPs，其飽和吸附容量及平衡吸附時(shí)間存在差異。由圖4a可知，在200 μg/mL花椒麻味物質(zhì)溶液中，MIP4、MIP5的飽和吸附容量相近，分別為 27.62 μg/mg 和 26.28 μg/mg，平衡吸附時(shí)間相同，均為4.5 h，這可能是由于致孔劑乙腈和甲醇對(duì)花椒麻味類(lèi)似物及功能單體的相互作用力均較小的緣故，符合計(jì)算機(jī)分子模擬結(jié)果；MIP6的飽和吸附量為20.35 μg/mg，平衡吸附時(shí)間為5.5 h，說(shuō)明氯仿對(duì)花椒麻味類(lèi)似物及功能單體的作用力較大，不利于MIPs的合成。由圖4b可知，MIP4在低于200 μg/mL的花椒麻味物質(zhì)溶液中快速吸附花椒麻味物質(zhì)，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度大于200 μg/mL時(shí)，吸附容量不再增加；而MIP5、MIP6在低于200 μg/mL花椒麻味物質(zhì)溶液中達(dá)到飽和吸附。MIP4在高濃度溶液中達(dá)到飽和吸附且吸附容量大，說(shuō)明MIP4印跡空穴多，與計(jì)算機(jī)分子模擬結(jié)果相符。

以上結(jié)果說(shuō)明，采用計(jì)算機(jī)Hartree-Fock方法，運(yùn)用6-31G+（d）基組選取極化連續(xù)溶劑模型（PCM），以溶劑化能篩選致孔劑具有實(shí)用性。

圖4 不同致孔劑的MIPs動(dòng)態(tài)、靜態(tài)結(jié)合曲線Fig.4 Dynamic binding and static binding curves of MIPs with different pore forming agents

3 結(jié)論

運(yùn)用計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)篩選出適合于花椒麻味類(lèi)似物的功能單體為甲基亞氨基二乙酸，致孔劑為乙腈，并根據(jù)實(shí)際情況確定花椒麻味類(lèi)似物與功能單體的物質(zhì)的量比為1∶4。在此基礎(chǔ)上，用甲基亞氨基二乙酸、乙烯基苯甲酸、MAA3種功能單體及乙腈、甲醇、氯仿3種致孔劑制備相應(yīng)的MIPs，通過(guò)考察它們的動(dòng)態(tài)吸附與靜態(tài)吸附能力，得出與計(jì)算機(jī)分子模擬相符的結(jié)果，驗(yàn)證了計(jì)算機(jī)分子模擬結(jié)果的準(zhǔn)確性。