一種配合飼料替代雜魚對三疣梭子蟹蛻殼生長、消化酶和免疫酶活力的影響

羅佶龍，彭瑩瑩，李澤良，蔡雅松，何 杰，許文軍，謝建軍

(浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316021)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus，以下簡稱梭子蟹)肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，是我國重要的經(jīng)濟蟹類。自上世紀90年代人工育苗技術(shù)突破以來，梭子蟹養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴大，已成為沿海地區(qū)的主要養(yǎng)殖品種之一，2016年全國養(yǎng)殖產(chǎn)量已達12.53萬t[1]。但目前梭子蟹養(yǎng)殖仍然采用投喂冰鮮雜魚的投喂模式，然而雜魚具有來源不穩(wěn)定、質(zhì)量不可控、攜帶病原體、易破壞水質(zhì)等問題嚴重影響了梭子蟹人工養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展[2-5]。因此，采用配合飼料替代雜魚是梭子蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必經(jīng)之路。本研究團隊近年來在梭子蟹的營養(yǎng)需求研究基礎(chǔ)上，開發(fā)了一款配合飼料，該配合飼料對梭子蟹生長效果尚未得到評估和驗證。

蝦蟹類甲殼動物的生長是伴隨著蛻殼過程實現(xiàn)的，蛻殼周期的長短、蛻殼后的增重率和特定生長率是直接反應(yīng)蝦蟹類生長速度的重要指標[6]。同時，蝦蟹類機體消化酶和免疫酶活性可有效反應(yīng)其對不同餌料的適應(yīng)性以及攝食不同餌料后的代謝水平和健康狀況[7-8]。

本研究在室內(nèi)單體養(yǎng)殖條件下，使用團隊自主研發(fā)的配合飼料全替代或半替代雜魚投喂梭子蟹，研究該配合飼料替代雜魚對梭子蟹幼蟹的生長蛻殼、消化酶活性以及非特異免疫能力的影響，旨在初步了解該配合飼料對梭子蟹的生長性能和內(nèi)在指標的影響，為評估該配合飼料替代雜魚的可行性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗用蟹與養(yǎng)殖條件

實驗于2017年在浙江省海洋水產(chǎn)研究所試驗場開展。7月中旬使用餌料誘捕的方式從養(yǎng)殖生產(chǎn)池塘中捕獲300余只梭子蟹幼蟹暫養(yǎng)至室內(nèi)水泥池(長×寬×高為8 m×1.8 m×1 m)中備用。次日從中選取120只規(guī)格相近(體重為20～30 g)、十足健全，無明顯傷痕且行動敏捷的雌體，分別養(yǎng)殖于120個單體塑料筐(長×寬×高為25 cm×15 cm×12 cm)內(nèi)。塑料筐四周用泡沫浮力架固定，使筐體浮于水面，框底沒于水面下約為10 cm處，筐體上方蓋一孔徑為1.8 cm的塑料網(wǎng)以防止幼蟹外逃。所有塑料筐設(shè)置在同一個水泥池內(nèi)，水深 0.4 m，水溫 28±1 ℃，鹽度 26，pH 8.2±0.1，連續(xù)增氧，DO＞5 mg·L-1，亞硝酸鹽濃度＜0.15 mg·L-1，氨氮濃度＜0.5 mg·L-1，實驗期間每日上午8:00清除殘餌并換水1/3，維持良好水質(zhì)。

1.2 餌料設(shè)計與飼養(yǎng)管理

將120只梭子蟹隨機的均分為三組，分別為完全投喂配合飼料組(全替代模式(M1))、配合飼料和雜魚混合投喂組(半替代模式(M2)，配合飼料與雜魚混合比例為1:3))以及完全投喂雜魚組(0替代模式(M3))，實驗期間所用配合飼料為團隊自主開發(fā)的配合飼料(配合飼料的常規(guī)生化和脂肪酸組成如表1、2)。每日下午6點投餌，投餌量根據(jù)攝食情況及時調(diào)整(整體上M1組投喂量為蟹體重的3%～4%；M2組投喂量為蟹體重的5%～8%；C組投喂重量為蟹體重8%～12%的雜魚)，次日上午清掃塑料筐內(nèi)的殘餌和糞便，即時撈出死亡個體以免污染水體。

實驗期間每日觀察蟹體的蛻殼情況，記錄蛻殼時間，待新蛻殼的幼蟹甲殼變硬后用毛巾輕輕擦拭體表水分并稱量體質(zhì)量和甲寬，根據(jù)以下公式計算增重率和特定生長率。

公式中，WGR為增重率(%)，SGR為特定生長率(%)，Wn為蛻殼后平均體重(g)，Wn-1為蛻殼前平均體重(g)，t蛻殼周期(d)。

表1 配合飼料和雜魚的常規(guī)生化組成Tab.1 Conventional biochemical composition of formula feed and trash fish

表2 配合飼料和雜魚的脂肪酸組成（%總脂肪酸）Tab.2 Fatty acid composition of formula feed and trash fish（%total fatty acids）

1.3 酶活力測定

隨機選取第二次蛻殼后約10 d的梭子蟹進行解剖，每個替代組5只蟹，用于酶活力測定。取樣時先擦干蟹體體表水分，用1 mL無菌注射器從其游泳足基部抽取1 mL左右血淋巴裝于2 mL離心管中，然后活體剝開甲殼，取出肝胰腺、胃裝于凍存管中，所有樣品保存于-80℃超低溫冰箱中，備用于檢測消化酶和免疫酶的活性。

消化酶活力的測定：準確稱取一定量的胃和肝胰腺組織重量，分別將稱取的組織放入各自的勻漿器，再用移液槍準確加入其9倍體積的生理鹽水制成10%的組織勻漿液，在冰浴條件下充分勻漿后置于低溫離心機以2 500 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液即為待測的粗酶液。胰蛋白酶、胃蛋白酶和脂肪酶的活性測定均按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)操作步驟準確測定。

非特異性免疫酶的測定：將解凍后的血淋巴置于低溫離心機內(nèi)，在4℃、5 000 r·min-1的條件下離心10 min后取其上清液為待測液。血清與上述肝胰腺粗酶液的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)的酶活性均使用試劑盒(南京建成生物工程研究所)生產(chǎn)測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗所得數(shù)據(jù)均用平均值±標準差表示，使用SPSS 20.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，對不同模式間采用單因子ANOVA進行方差分析，使用Tukey-HSD法進行多重比較，取P＜0.05為差異顯著標準，相關(guān)圖表在Excel上繪制。

2 結(jié)果

2.1 配合飼料替代雜魚對梭子蟹蛻殼和生長性能的影響

由圖1可見，在第一次蛻殼中，M1組幼蟹蛻殼周期顯著長于M2和M3組P＜0.05)，且M3幼蟹組略長于M2組 (P＞0.05)；第二次蛻殼中，M1中的幼蟹蛻殼周期顯著長于M3組(P＜0.05)，M2介于M1和M3之間，但與M1和M3差異均不顯著(P＞0.05)；另外，各實驗組幼蟹的第二次蛻殼周期均較長于第一次的蛻殼周期。

圖1 配合飼料替代雜魚對梭子蟹蛻殼周期的影響Fig.1 Effect of formula feed replacement of trash fish on the molting cycle of P.trituberculatus

如表3所示，第一次蛻殼后，各替代組幼蟹的體重與甲長并無顯著差異，而在第二次蛻殼后，M1組幼蟹的體重與甲長均顯著低于M2和M3組(P＜0.05)，且M2組幼蟹體重和甲長均略高于M3組；就增重率(WGR)和特定生長率(SGR)而言(圖2-3)，第一次蛻殼后3組之間的WGR無顯著差異(P＞0.05)，但M1組的SGR顯著低于M2和M3組(P＜0.05)，M2與M3組間幾乎無差異(P＞0.05)；第二次蛻殼后，無論是WGR還是SGR，M1組均顯著低于M2和M3組(P＜0.05)，而M2和M3組卻十分接近；另外，由圖2可見，3個替代組中，僅M1組幼蟹第二次蛻殼后的WGR顯著低于第一次蛻殼后的增重率；而3個替代組第二次蛻殼后的SGR均為第一次蛻殼的1/2左右(圖3)。

表3 配合飼料替代雜魚對梭子蟹體重、甲長變化的影響Tab.3 Effect of formula feed replacement of trash fish on the weight and length of P.trituberculatus

2.2 配合飼料替代雜魚對梭子蟹消化酶活性的影響

從圖4、5可見，3個替代組幼蟹的胃和肝胰腺的蛋白酶和脂肪酶活性規(guī)律一致，均為M1＞M2＞M3，但各組間差異均不顯著(P＞0.05)；M1組幼蟹的胃和肝胰腺的淀粉酶活性均顯著高于M2和M3組(P＜0.05)，而M2和M3組幼蟹中的淀粉酶活性均較為接近(P＞0.05)(圖6)。

圖2 配合飼料替代雜魚對梭子蟹蛻殼后增重率的影響Fig.2 Effect of formula feed replacement of trash fish on the growth rate of P.trituberculatus after molting

圖3 配合飼料替代雜魚對梭子蟹蛻殼后特定生長率的影響Fig.3 Effect of formula feed replacement of trash fish on specific growth rate of P.trituberculatusafter Molting

圖4 配合飼料替代雜魚對梭子蟹胃和肝胰腺中的蛋白酶活性的影響Fig.4 Effect of formula feed replacement of trash fish on protease activity in stomach and hepatopancreas of P.trituberculatus

圖5 配合飼料替代雜魚對梭子蟹胃和肝胰腺中的淀粉酶活性的影響Fig.5 Effects of formula feed replacement of trash fish on amylase activity in stomach and hepatopancreas of P.trituberculatus

圖6 配合飼料替代雜魚對梭子蟹胃和肝胰腺中的脂肪酶活性的影響Fig.6 Effects of formula feed replacement of trash fish on lipase activity in stomach and hepatopancreas of P.trituberculatus

2.3 配合飼料替代雜魚對梭子蟹非特異性免疫酶活性的影響

由圖7可見，M2組幼蟹肝胰腺中的超氧化物歧化酶活性較高于M1和M3組，但3個替代組幼蟹血淋巴和肝胰腺中的超氧化物歧化酶活性均無顯著差異 (P＞0.05)；3個替代組中，M2和M3組幼蟹血淋巴和肝胰腺中的過氧化氫酶活性相近且較高于M1組 (圖8)；3個替代組幼蟹血淋巴和肝胰腺中的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均無顯著差異，但整體上是M2組較高于M1和M3組(圖9、10)。

圖7 配合飼料替代雜魚對梭子蟹血淋巴和肝胰腺中的SOD活性的影響Fig.7 Effects of formula feed replacement of trash fish on superoxide dismutase(SOD)activity in hemolymph and hepatopancreas of P.trituberculatus

圖8 配合飼料替代雜魚對梭子蟹血淋巴和肝胰腺中CAT活性的影響Fig.8 Effects of formula feed replacement of trash fish on catalase activity(CAT)in hemolymph and hepatopancreas of P.trituberculatus

圖9 配合飼料替代雜魚對梭子蟹血淋巴和肝胰腺中ACP活性的影響Fig.9 Effects of formula feed replacement of trash fish on acid phosphatase(ACP)activity in hemolymph and hepatopancreas of P.trituberculatus

圖10 配合飼料替代雜魚對梭子蟹血淋巴和肝胰腺中AKP活性的影響Fig.10 Effects of formula feed replacement of trash fish on alkaline phosphatase(AKP)activity in hemolymph and hepatopancreas of P.trituberculatus

3 討論

3.1 配合飼料替代雜魚對梭子蟹生長性能的影響

群體養(yǎng)殖條件下梭子蟹在蛻殼期間的自相殘殺極其嚴重，而單體養(yǎng)殖的方式不僅可提高養(yǎng)殖成活率，并且可精確的觀察實驗期間梭子蟹每個個體的攝食行為、蛻殼周期以及蛻殼后的增重率和特定生長率[9]。因此，本研究采用了單體養(yǎng)殖的方式研究配合飼料替代雜魚對梭子蟹生長性能的影響，從研究結(jié)果看，配合飼料全替代和半替代雜魚組的梭子蟹均能順利蛻殼和生長，但全替代組的梭子蟹2次蛻殼周期均顯著長于全雜魚組，而且蛻殼后的特定生長率也顯著低于全雜魚組，說明本研究所用配合飼料尚不能完好的滿足梭子蟹的營養(yǎng)需求，其營養(yǎng)成分含量或配比較差于雜魚；至于全替代組梭子蟹的第二次蛻殼周期、增重率和特定生長率的差異較第一次有所減小，可能是隨著養(yǎng)殖周期的延長梭子蟹對配合飼料的適應(yīng)性會有所提高[10]。令人可喜的是，半替代組梭子蟹的蛻殼周期以及蛻殼后的增重率和特定生長率等生長指標均能達到全雜魚組的水平，甚至最終體重略高于全雜魚組，這可能得益于配合飼料能彌補野雜魚營養(yǎng)成分上的不足，野雜魚自帶的一些有益菌又能提高配合飼料的利用率[11]，這暗示該實驗配合飼料和雜魚在營養(yǎng)上均有不足之處，而混合投喂可以使兩者優(yōu)勢互補，達到營養(yǎng)與適口性俱佳的目的。

3.2 配合飼料替代雜魚對梭子蟹消化酶活性的影響

蝦蟹類消化能力的強弱很大程度上取決于消化酶的活性，而消化酶活性與餌料的種類和營養(yǎng)組成有著密切關(guān)系[12]。本研究發(fā)現(xiàn)配合飼料全替代和半替代雜魚的投喂模式均未對梭子蟹胃和肝胰腺中的蛋白酶活性產(chǎn)生顯著影響，這與施永海等[13]使用配合飼料替代鮮活餌料飼養(yǎng)刀鱭幼魚的結(jié)果一致，這可能是因為偏肉食性的動物，其消化酶活性不能大幅度改變以適應(yīng)配合飼料；但全替代模式顯著提高了梭子蟹胃和肝胰腺中的淀粉酶活性，一方面可能是梭子蟹不能有效利用配合飼料中植物性蛋白源，而動物性蛋白源又并不充足，只能通過提高對淀粉的利用率來滿足能量上的需求，相比之下半替代的投喂模式中混合餌料的動物性蛋源相對充足，其無需提高淀粉的利用率，以致淀粉酶活性與雜魚組無明顯差異；另一方面也可能與配合飼料中含有大量富含淀粉的面粉有關(guān)，機體需要提高淀粉酶的活性來加速對配合飼料中淀粉的消化。梭子蟹的消化能力對本研究中的配合飼料有一定的適應(yīng)性，這說明就消化能力而言該配合飼料作為可靠餌料替代雜魚養(yǎng)殖梭子蟹是可期的。

3.3 配合飼料替代雜魚對梭子蟹非特異性免疫酶活性的影響

甲殼動物因其無法產(chǎn)生免疫球蛋白，而缺乏獲得性免疫能力，所以自身的非特異性免疫肩負了保護機體的主要責(zé)任，其中SOD和CAT是抗氧化酶中十分重要的兩種酶，SOD能歧化活性氧自由基，產(chǎn)生H2O2和O2，而CAT能使H2O2還原成水，從而降低活性氧對細胞的損傷；ACP、AKP是非特異性免疫系統(tǒng)中重要的兩種水解酶[14]，同時也是巨噬細胞的標志酶[15]，并且還參與甲殼動物的磷、鈣、DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝[16]。本研究中全替代組各種酶的活性均較低于雜魚組，這可能還是與該配合飼料不能較好滿足梭子蟹的營養(yǎng)需求，致使機體代謝水平降低有關(guān)；而半替代組梭子蟹中除血淋巴中的ACP和SOD活性略低于全雜魚組外，其余的ACP、AKP、SOD以及CAT活性均高于雜魚組，可能是配合飼料原料(豆粕等)中含有較豐富的P元素，機體需要提高ACP和AKP的活性，以加快磷的代謝[16]，并且飼料中添加的維生素C(VC)和維生素E(VE)等抗氧化物質(zhì)提高了機體抗氧化酶(SOD和CAT)的活性。整體上，完全攝食本研究所用配合飼料將降低梭子蟹免疫能力，而采用該配合飼料和雜魚混合投喂可提高梭子蟹的免疫能力。

4 小結(jié)

綜合生長性能、消化酶和非特異性免疫酶活性等參數(shù)，本研究認為階段性的使用該配合飼料部分替代雜魚養(yǎng)殖梭子蟹是可行的，至于是否能在池塘養(yǎng)殖條件下全程使用還有待進一步驗證。另外，使用配合飼料全替代雜魚將顯著影響梭子蟹的蛻殼生長和消化能力，但是完全投喂該配合飼料仍能使梭子蟹順利蛻殼生長，那么池塘養(yǎng)殖生產(chǎn)條件下全程完全使用配合飼料后最終的養(yǎng)殖效果如何仍值得研究與探討。