亢奮恒 張博文 戴大鵬 李傳寶 蔡劍平
研究報(bào)道稱細(xì)胞色素P2C9(CYP2C9)是人類最重要的藥物代謝酶。細(xì)胞色素P2C9是P450酶家族中的重要成員,是肝微粒體中一種十分重要的藥物代謝酶,催化10%~20%臨床常用藥物在肝內(nèi)的代謝[1,2]。大量研究表明,細(xì)胞色素P2C9具有眾多等位基因,大部分突變體蛋白的活性呈現(xiàn)明顯下降,是引起某些藥物代謝能力個(gè)體差異的重要原因[3,4]。
在1例常年口服低劑量(1.5~2.0mg/d)華法林患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種的新的細(xì)胞色素P450 2C9變異型,在1號(hào)外顯子32位發(fā)生了T>C突變,引起Leu11>Pro11的氨基酸改變。為探究其催化能力是否發(fā)生明顯改變,本研究引入甲苯磺丁脲作為探針?biāo)?。根?jù)以往研究,作為其重要代謝底物之一的甲苯磺丁脲,在人體內(nèi)代謝途徑單一,幾乎均由肝細(xì)胞色素P2C9催化代謝,是絕大多數(shù)細(xì)胞色素P2C9研究者必選的探針?biāo)嶽5,6]。
現(xiàn)有研究表明,中國(guó)人群中最常見的細(xì)胞色素P2C9缺陷型突變體為細(xì)胞色素P2C9*3和*13,其中以*3最為多見,故本研究引入野生型* 1和突變型* 3 作為參照,通過對(duì)比3種細(xì)胞色素P2C9對(duì)底物藥甲苯磺丁脲的催化速率,以期指導(dǎo)該等位基因攜帶者的個(gè)體化用藥。
1.材料:(1)主要試劑:Trans5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司);DH10 Bac化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(美國(guó) Invitrogen公司);Spodoptera frugiperda昆蟲細(xì)胞,Sf-900TMⅢSFM昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基,胎牛血清及Bac-to-Bac Baculovirus Expression System(美國(guó)Invitrogen公司),Prime STAR MAX DNA聚合酶、DNA連接試劑盒(日本TaKaRa公司),商業(yè)化CYP2C9微粒體及細(xì)胞色素b5微粒體(美國(guó)BD Gentest公司),兔抗人CYP2C9多克隆抗體(英國(guó)AbD serotec公司),小鼠抗人OR單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司),HRP標(biāo)記的羊抗兔及羊抗鼠二抗(北京中杉金橋公司),蛋白定量及ECL顯色kit(美國(guó)Pierce公司),甲苯磺丁脲(美國(guó)Sigma公司),4-Hydroxytolbutamide(加拿大Toronto Research Chemicals公司),NADPH生成系統(tǒng)(北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司),HPLC級(jí)溶劑(美國(guó)Fisher Scientific公司),其余常規(guī)試劑均為優(yōu)級(jí)純或分析純。(2)主要儀器:冷凍離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)(日本Kubota公司),PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)、細(xì)胞超聲破碎儀(美國(guó) Sonic公司),電泳儀及水平電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司)、Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司),Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司),所用常規(guī)耗材均購(gòu)自美國(guó)Axygen公司。
2.CYP2C9基因定點(diǎn)誘變和ORF區(qū)擴(kuò)增引物設(shè)計(jì):根據(jù)NCBI公布的CYP2C9全基因組序列(NM 000771.3),利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)開放閱讀框(ORF)區(qū)擴(kuò)增引物、突變位點(diǎn)相應(yīng)的上下游寡核苷酸引物(分別命名為-2F和-1R)以及測(cè)序引物(表1),引物由北京天一輝遠(yuǎn)公司合成。
3.pFastBac-dual-OR-2C9雙表達(dá)載體的構(gòu)建:將美國(guó)Origen公司購(gòu)買的細(xì)胞色素P450氧化還原酶(CYPOR)的ORF區(qū)擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收,回收之后進(jìn)行XhoⅠ/KpnⅠ雙酶切,再將產(chǎn)物與同樣雙酶切的空載體 pFastBac-dual連接,即獲得可接收 CYP2C9 擴(kuò)增產(chǎn)物的中間載體pFastBac-dual-OR。利用重疊延伸PCR技術(shù),以細(xì)胞色素P2C9*1質(zhì)粒為模板,獲得細(xì)胞色素P2C9*3、細(xì)胞色素P2C9(32T>C)的cDNA全長(zhǎng)[7,8]。將細(xì)胞色素P2C9的cDNA區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后進(jìn)行EcoRΙ/SalΙ雙酶切,與同樣酶切的中間載體pFastbac-dual-OR(含CYPOR的結(jié)構(gòu)基因)連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞后用PCR法篩選陽(yáng)性克隆,挑取陽(yáng)性克隆隔夜搖菌,提取質(zhì)粒后送北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行序列測(cè)定,以確認(rèn)所獲載體中定點(diǎn)誘變位點(diǎn)堿基與設(shè)計(jì)完全一致。
表1 構(gòu)建CYP2C9重組質(zhì)粒載體的引物
下劃線處序列為限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn),下劃線處堿基為突變位點(diǎn);CYP2C9(32T>C)突變位點(diǎn)為1號(hào)外顯子第32位,CYP2C9*3突變位點(diǎn)為7號(hào)外顯子第1075位
4.桿粒載體Bacmid-OR-CYP2C9s的制備及PCR驗(yàn)證:陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10bac感受態(tài)細(xì)胞以后,篩選陽(yáng)性克隆,挑取陽(yáng)性克隆隔夜搖菌,利用桿狀病毒穿梭載體bacmid抽提試劑盒提取重組桿粒DNA,并進(jìn)行PCR驗(yàn)證,驗(yàn)證所用引物如下(表2)。
表2 對(duì)重組桿粒載體進(jìn)行PCR驗(yàn)證的正向和反向引物
5.桿狀病毒的獲得和增殖:參照Bac-to-Bac Baculovirus Expression System試劑盒使用說明,包裝Bacmid-OR-CYP2C9昆蟲病毒,所獲病毒侵染偽黏蟲卵巢細(xì)胞,觀察細(xì)胞在不同生長(zhǎng)階段的特征(表3),在轉(zhuǎn)染后期階段收集P1代病毒,利用獲得的P1代病毒繼續(xù)擴(kuò)增產(chǎn)生P2代病毒。
表3 病毒侵染后的偽黏蟲卵巢細(xì)胞不同生長(zhǎng)階段顯微鏡下特征
6.高表達(dá)細(xì)胞色素P2C9昆蟲微粒體的獲得:將P2代病毒上清繼續(xù)培養(yǎng),72h后離心收集細(xì)胞,洗滌后重懸于5ml重懸液(0.25mol/L蔗糖,1mmol/L EDTA,0.5mmol/L PMSF)中,利用超聲破碎儀進(jìn)行破碎,破碎產(chǎn)物經(jīng)12000g 離心后去除細(xì)胞碎片,將得到的上清經(jīng)100000g超速離心,再將得到的沉淀物(微粒體)重懸于微粒體儲(chǔ)存液中,凍存于-80℃冰箱。
7.使用免疫印跡法對(duì)重組細(xì)胞色素P2C9突變型蛋白進(jìn)行鑒定:用BCA法測(cè)定微粒體蛋白濃度,取5μg進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)束后樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用封閉液封閉,封閉后進(jìn)行一抗孵育(一抗選擇兔抗人CYP2C9抗體和鼠抗人CYPOR抗體),4℃條件下孵育過夜,次日將PVDF膜取出洗滌后進(jìn)行二抗孵育(二抗選擇山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG),滴加曝光液后用化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。
8.LCMS/MS檢測(cè)細(xì)胞色素P2C9對(duì)甲苯磺丁脲的代謝:(1)催化體系:由重組細(xì)胞色素P2C9蛋白、細(xì)胞色素b5、NADPH輔酶、Tris-HCl以及甲苯磺丁脲組成200μl反應(yīng)體系。(2)催化過程:37℃孵育1h后,加入氯磺丙脲和HCl,置于渦旋震蕩器震蕩 2min,加入冰乙酸乙酯繼續(xù)渦旋震蕩2min,離心后轉(zhuǎn)移有機(jī)層,用氮吹儀吹干,加入100μl流動(dòng)相復(fù)溶并取20μl于Agilent 1200高效液相色譜儀檢測(cè)。(3)色譜檢測(cè)條件:色譜柱為ZORBAX EclipseXDB-C18柱(4.6mm×150.0mm,5μm,美國(guó)Agilent公司),流動(dòng)相為0.05%TFA∶乙腈=70∶30,流速為0.4ml/min,柱溫40℃,上樣體積為2μl,內(nèi)標(biāo)為氯磺丙脲。(4)最大反應(yīng)速度Vm及米氏常數(shù)Km值的計(jì)算:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,將代謝產(chǎn)物4-Hydroxytolbutamide定量后,利用Prism軟件(version 5,美國(guó)GraphPad公司)計(jì)算Vm、Km值以及清除率(Vm/Km)。
1.對(duì)新細(xì)胞色素P2C9突變體重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證:以CYP2C9-EF和CYP2C9-SR為引物,將提取的pFastBac-dual-OR-2C9重組質(zhì)粒送北京天一輝遠(yuǎn)公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果用Oligo7軟件進(jìn)行序列分析,箭頭所指處顯示,堿基T→C誘變成功(圖1)。
圖1 細(xì)胞色素P2C9新突變型重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果
2.利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì)重組質(zhì)粒載體進(jìn)行鑒定:將提取的pFastBac-dual-OR-2C9重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,大小約1500bp(圖2)。
圖2 重組細(xì)胞色素P2C9質(zhì)粒載體PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果
3.使用免疫印跡法對(duì)重組細(xì)胞色素P2C9突變型蛋白進(jìn)行定性檢測(cè):免疫印跡結(jié)果顯示,在同一張PVDF膜55000與78000左右出現(xiàn)以下兩個(gè)條帶(圖3),與目標(biāo)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量接近,箭頭以上條帶為細(xì)胞色素P2C9(相對(duì)分子質(zhì)量約為53000~55000),箭頭以下條帶為細(xì)胞色素P450氧化還原酶(相對(duì)分子質(zhì)量約為78000)。
圖3 免疫印跡法檢測(cè)重組細(xì)胞色素P2C9微粒體蛋白STD.購(gòu)自美國(guó)BD Gentest公司的CYPC29標(biāo)準(zhǔn)品;OR.只表達(dá)細(xì)胞色素P450氧化還原酶的陰性對(duì)照
4.使用免疫印跡法對(duì)重組細(xì)胞色素P2C9突變型蛋白進(jìn)行定量檢測(cè):將美國(guó)BD Gentest公司購(gòu)買的細(xì)胞色素P2C9*1微粒體標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋為2.4、1.2、0.6和0.3pmol/μl 4種不同濃度(圖4),利用Image J軟件進(jìn)行灰度分析后,經(jīng)對(duì)比定量計(jì)算,重組微粒體細(xì)胞色素P2C9*1、重組細(xì)胞色素P2C9*3、重組細(xì)胞色素P2C9(32T>C)濃度分別為:2.256、2.103、2.434pmol/μl。
圖4 免疫印跡法對(duì)重組細(xì)胞色素P2C9進(jìn)行定量檢測(cè)S1~S4分別為2.4、1.2、0.6、0.3pmol/μl 4種不同濃度的CYP2C9標(biāo)準(zhǔn)品
5.細(xì)胞色素P2C9(32T>C)對(duì)甲苯磺丁脲的催化活性:體外代謝檢測(cè)結(jié)果表明,細(xì)胞色素P2C9(32T>C)對(duì)于甲苯磺丁脲的清除率為野生型*1的12.40%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。細(xì)胞色素P2C9(32T>C)對(duì)甲苯磺丁脲的清除率明顯低于野生型,接近典型突變型*3(圖5)。
表4 細(xì)胞色素P2C9催化甲苯磺丁脲代謝的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)
與CYP2C9*1比較,*P<0.05
圖5 細(xì)胞色素P2C9催化甲苯磺丁脲的酶促動(dòng)力學(xué)曲線圖
作為人體肝臟中一種非常重要的藥物代謝酶,細(xì)胞色素P2C9不僅含量豐富(約占細(xì)胞色素P450總量的20%),而且可以催化眾多不同類型藥物的代謝[9~12]。從中選擇哪些藥物作為研究的底物藥,是首先要考慮的問題。雖然該突變型是從1例華法林慢代謝型患者身上發(fā)現(xiàn)的,但由于人體對(duì)華法林的代謝受多種因素影響,除了細(xì)胞色素P2C9以外,VKORC1的基因多態(tài)性也具有重要影響[13,14]。本研究?jī)H對(duì)攜帶者CYP2C9基因編碼區(qū)的9個(gè)外顯子進(jìn)行測(cè)序,并不知道VKORC1等基因的變異情況。因此,單獨(dú)研究細(xì)胞色素P2C9對(duì)華法林的代謝功能,對(duì)于患者個(gè)體化用藥的指導(dǎo)意義并不是很大。相比之下,甲苯磺丁脲在人體內(nèi)代謝途徑單一,80%以上在肝內(nèi)被細(xì)胞色素P2C9羥化代謝,是體外研究細(xì)胞色素P2C9活性的絕佳底物藥[15]。
與其他細(xì)胞色素P450家族比較,細(xì)胞色素P2C9的等位基因在人群中存在高度的遺傳多態(tài)性,目前已被統(tǒng)計(jì)命名的有60種,其中最常見的突變型是*2和*3,它們和野生型細(xì)胞色素P2C9*1是目前研究最多的3種型別[16~19]。中國(guó)人群中最常見的突變類型是*3與*13,其中以*3最為多見,故本項(xiàng)研究選擇了我國(guó)人群中最多見的細(xì)胞色素P2C9基因型*1和*3作為參照,通過對(duì)比對(duì)細(xì)胞色素P2C9(32T>C)新突變型的催化功能作出評(píng)價(jià)。
Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明,細(xì)胞色素P2C9(32T>C)的蛋白表達(dá)量與野生型比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明該變異基因并未影響蛋白質(zhì)的正常表達(dá)。體外藥物代謝檢測(cè)結(jié)果顯示,細(xì)胞色素P2C9*3的清除率為9.09%,與以往研究結(jié)果相似,說明在同等條件下測(cè)得的細(xì)胞色素P2C9(32T>C)的催化活性具有一定的可信度。細(xì)胞色素P2C9(32T>C)對(duì)于探針?biāo)幬锛妆交嵌‰宓捏w外清除率為細(xì)胞色素P2C9野生型的12.40%,略高于細(xì)胞色素P2C9*3(表4)。酶促反應(yīng)曲線顯示細(xì)胞色素P2C9(32T>C)對(duì)甲苯磺丁脲的催化能力接近于典型突變型細(xì)胞色素P2C9*3,酶學(xué)活性明顯下降,提示攜帶該基因型的患者服用經(jīng)由細(xì)胞色素P2C9代謝的藥物時(shí),體內(nèi)藥物代謝速率可能會(huì)發(fā)生不同程度的降低,用藥時(shí)忽視這一點(diǎn)可能會(huì)造成藥物在體內(nèi)蓄積,引發(fā)不良反應(yīng)甚至毒性反應(yīng)(圖5)。
以往研究表明,細(xì)胞色素P2C9的催化作用具有底物依賴性,即對(duì)不同底物呈現(xiàn)出不同程度的活性改變,提示細(xì)胞色素P2C9(32T>C)在催化其他種類藥物代謝時(shí)可能會(huì)表現(xiàn)出不同的活性。本項(xiàng)研究選用細(xì)胞色素P2C9的特異性探針?biāo)幖妆交嵌‰遄鳛闄z測(cè)活性的底物藥,雖然對(duì)臨床用藥具有重要的指導(dǎo)作用,但仍然有必要開展大量體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步全面研究該突變型的催化功能。