感染人附紅細(xì)胞體SD大鼠模型的構(gòu)建

白 靜 陳 瑤 郝 雷 劉寰宇

人附紅細(xì)胞體病(human eperythrozoonosis,HE)是由附紅細(xì)胞體寄生于人紅細(xì)胞表面、血漿、骨髓等多部位引起的一種人獸共患性傳染病[1]。該疾病廣泛存在于許多國家和地區(qū)，多發(fā)于夏秋季節(jié)，條件性致病，具有感染率高，發(fā)生率低的特點(diǎn)，免疫力低下時易發(fā)病[2]。一般認(rèn)為接觸傳播、血源性傳播、垂直傳播、以及昆蟲媒介傳播等，為可能的傳播途徑。附紅細(xì)胞體感染后是否發(fā)病，由個體的免疫狀態(tài)決定。病變主要在肝臟、脾臟、淋巴結(jié)，也可累及心肺[3]。主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、乏力、出汗、脫發(fā)，關(guān)節(jié)疼痛，嚴(yán)重時出現(xiàn)黃疸、肝脾大等[4]。臨床診斷主要以在血液中查出附紅體并伴有發(fā)熱、貧血、乏力、關(guān)節(jié)腫大等典型表現(xiàn)并結(jié)合其職業(yè)、居住地區(qū)等進(jìn)行綜合判斷。目前臨床治療上，可用的藥物種類繁多，有四環(huán)素類、氨基糖苷類和青蒿霉素等，但多數(shù)用藥后雖可控制臨床癥狀，但極易復(fù)發(fā)[5]。 鑒于附紅細(xì)胞體病的研究現(xiàn)狀，對其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究顯得尤為重要，但自1921年附紅細(xì)胞體病首次被報道后，2000年出現(xiàn)短暫的研究熱度至今，研究進(jìn)行緩慢，一方面是關(guān)于此病的臨床報道少，病例收集困難；另一方面，實(shí)驗室研究中多集中于畜牧獸醫(yī)對豬、牛等經(jīng)濟(jì)動物模型的構(gòu)建及研究，對于人附紅細(xì)胞體動物感染模型的構(gòu)建，尚未見報道。因此，本研究通過人工感染實(shí)驗動物的方法，建立人附紅細(xì)胞體感染的動物模型，可為人附紅細(xì)胞體病發(fā)病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，以期推進(jìn)人附紅細(xì)胞體病的臨床研究。

材料與方法

1.實(shí)驗動物:SPF級SD大鼠30只，6周齡，雌雄各半，購自北京維通利華動物公司，實(shí)驗動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。

2.分組:動物進(jìn)入動物飼養(yǎng)中心后立即經(jīng)尾靜脈采血，血涂片瑞氏染色，經(jīng)油鏡觀察有無附紅細(xì)胞體感染。確定無附紅細(xì)胞體感染后，用隨機(jī)數(shù)字表法將所有動物分為兩組，模型組和對照組。

3.飼養(yǎng)管理及環(huán)境:模型組15只和對照組15只單籠、單室、分開飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物中心屏障管理系統(tǒng)，飲用高壓滅菌水，食用SPF級鼠糧。采用8h和16h明暗交替照明，室溫控制在18～29℃，濕度控制在30%～40%。

4.人附紅細(xì)胞體血液樣本篩選:人附紅細(xì)胞體血液樣本來源于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院入院的患者，經(jīng)靜脈無菌采集抗凝血，經(jīng)血涂片瑞士染色，油浸物鏡(10×100oil)檢查其附紅細(xì)胞體感染情況。在血涂片的頭、體、尾部各隨機(jī)選取3個視野，每個視野計數(shù)200個紅細(xì)胞，計數(shù)200個紅細(xì)胞中被附紅體感染的紅細(xì)胞的個數(shù)，被感染紅細(xì)胞的總數(shù)與紅細(xì)胞總數(shù)的比值再乘以百分之百，即為該張血片的感染率。每張血片，計數(shù)3次，取平均值作為最終感染率。低于30%為輕度感染，30%～60%為中度感染，高于60%為重度感染。從中篩選重度感染的患者血樣備用。

5.分離純化人附紅細(xì)胞體:篩選出的重度感染的人附紅細(xì)胞體患者的抗凝血，2000r/min，離心10min，棄去上清液。在所剩的紅細(xì)胞泥中加入等體積阿氏垂懸紅細(xì)胞懸液。將其轉(zhuǎn)移置大號離心管中，加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液，2500r/min，離心20min，棄去白細(xì)胞層，將紅細(xì)胞泥用等體積的阿氏液垂懸，50℃水浴30min，使附紅細(xì)胞體與紅細(xì)胞分離。2000r/min離心30min,棄去上清，所得沉淀垂懸于適量的阿氏液(2.05g葡萄糖、0.42g氯化鈉、0.80g檸檬酸鈉、加蒸餾水至100ml，pH值為6.1，過濾后高壓滅菌)中，并用血細(xì)胞計數(shù)板將濃度調(diào)整為1×107個/微升此時用顯微鏡觀察，視野中可見運(yùn)動中的、大小不一的附紅細(xì)胞體。

6.人附紅細(xì)胞體感染SD大鼠模型構(gòu)建：(1)模型組：每只SD大鼠，腹腔注射人附紅細(xì)胞體分離純化液100μl(濃度為1×107個/微升)，每日1次，連續(xù)3天。對照組：每只SD大鼠，腹腔注射無菌生理鹽水100μl，每日1次，連續(xù)3天。實(shí)驗期間(0、3、5、7、9、11天)，每天上午8點(diǎn)，用電子體溫計測量記錄大鼠肛溫，同時觀察大鼠的精神狀態(tài)、攝食飲水情況、皮膚、鞏膜有無黃染、脫毛嚴(yán)重與否。

7.檢測人附紅細(xì)胞體感染SD大鼠的感染率：腹腔注射的SD大鼠第0、3、5、7、9、11天，于鼠尾靜脈采血進(jìn)行瑞氏染色。在血涂片上，根據(jù)血膜大小滴加3～5滴瑞氏染液(1.2g瑞氏染粉、80ml甘油、600ml甲醇，常溫放置3個月后，過濾使用)，使其迅速蓋滿血膜。再加1倍量的緩沖液，使染液與緩沖液充分混合，染色10min，固定血片。水洗30s，自然干燥后,經(jīng)油浸物鏡光學(xué)顯微鏡檢查計數(shù)其感染率，并觀察紅細(xì)胞大小、形態(tài)、顏色。

結(jié) 果

1.重度感染人附紅細(xì)胞體患者血液樣本篩選結(jié)果:在300例患者中篩選出18例附紅細(xì)胞體重度感染患者血液樣本(圖1)。圖1A為無感染人附紅細(xì)胞體血涂片，可見表面光滑、細(xì)胞膜完好的淡紅色細(xì)胞(10×100oil)。圖1B為重度感染人附紅細(xì)胞體血涂片：可見紅細(xì)胞被具有明顯折光性的棕褐色的小體附著(10×100oil)。

圖1 人附紅細(xì)胞體血液樣本瑞氏染色血涂片(10×100oil)A.無感染人附紅細(xì)胞體血涂片；B.重度感染人附紅細(xì)胞體血涂片

2.人附紅細(xì)胞體分離純化結(jié)果：從18例附紅細(xì)胞體重度感染患者血液樣本中分離出了15ml人附紅細(xì)胞體分離純化液原液，計數(shù)濃度后調(diào)整為34ml濃度為1×107個/微升的人附紅細(xì)胞體分離純化液(圖2)。圖2A可見棕褐色圓形小體的人附紅細(xì)胞體。圖2B可見人附紅細(xì)胞體具有明顯的折光性。

圖2 光鏡下人附紅細(xì)胞體分離純化液圖片(10×100oil)A.顯示人附紅細(xì)胞體為棕褐色圓形小體；B.顯示人附紅細(xì)胞體具有折光性

3.感染人附紅細(xì)胞體SD大鼠模型瑞氏染色結(jié)果：對照組SD大鼠，鼠尾靜脈采血進(jìn)行瑞氏染色結(jié)果(圖4)，從左到右依次為對照0、3、5、7、9、11天。對照組大鼠每天血涂片，感染率均為0,紅細(xì)胞均形態(tài)完整，呈淡粉色，無改變。

感染人附紅細(xì)胞體SD大鼠，鼠尾靜脈采血進(jìn)行瑞氏染色結(jié)果(圖3)，從左到右依次為感染0、3、5、7、9、11天。第0天，感染率為0，紅細(xì)胞呈淡粉色，邊緣整齊，未見寄生的人附紅細(xì)胞體；第3天，感染率為17.26%±1.33%，紅細(xì)胞邊緣有少量淺棕褐色、圓形附紅細(xì)胞體寄生，部分紅細(xì)胞邊緣突起；第5天，感染率為37.02%±1.48%，紅細(xì)胞變形，淡染區(qū)擴(kuò)大，其表面寄生的人附紅細(xì)胞體增多，血漿中也出現(xiàn)人附紅細(xì)胞體；第7天，感染率為67.37%±2.52%，紅細(xì)胞膜失去完整性，色淡、變大，血漿中發(fā)現(xiàn)活動的附紅體明顯增多；第9天，感染率為62.78%±2.34%，紅細(xì)胞表面及血漿中有大量人附紅體活動，但未見繼續(xù)增加；第11天，感染率為61.32%±1.69%，與第7天、第9天比較未見明顯變化。

圖3 模型組大鼠瑞士染色血涂片(10×100oil)A.感染第0天；B.感染第3天；C.感染第5天；D.感染第7天；E.感染第9天；F.感染第11天

圖4 對照組大鼠瑞士染色血涂片(10×100oil)A.感染第0天；B.感染第3天；C.感染第5天；D.感染第7天；E.感染第9天；F.感染第11天

4.感染人附紅細(xì)胞體SD大鼠模型感染率統(tǒng)計結(jié)果：復(fù)制感染人附紅細(xì)胞體SD大鼠模型，第0天，模型組和對照組大鼠均無附紅細(xì)胞體感染，兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；從感染第3天開始，模型組大鼠感染率分別為17.26%±1.33%、37.02%±1.48%、67.37%±2.52%、62.78%±2.34%、61.32%±1.69%， 顯著高于對照組(P<0.05)； 模型組感染第3天、第5天、第7天感染率隨著感染時間的延長，感染率逐漸升高(P<0.05)，模型組感染第7天、第9天、第11天感染率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖5)。

圖5 感染人附紅細(xì)胞體SD大鼠感染率

5.感染人附紅細(xì)胞體SD大鼠模型臨床癥狀：第0天、第3天、第5天、第7天、第11天受感染大鼠的體溫分別為37.87±0.18℃、38.4±0.19℃、38.86±0.18℃、38.68±0.18℃、38.5±0.18℃。實(shí)驗期間，對照組SD大鼠的精神狀態(tài)良好，體溫正常，攝食飲水情況正常，皮膚、鞏膜均無黃染、無明顯的脫毛現(xiàn)象。模型組SD大鼠從感染第3天開始出現(xiàn)精神萎靡，體溫升高與未感染前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，攝食飲水欠佳；感染第11天，有4只模型組SD大鼠出現(xiàn)鞏膜黃染，明顯脫毛的現(xiàn)象。

討 論

根據(jù)已知的人附紅細(xì)胞體的生物學(xué)特性可成功的將人附紅細(xì)胞體從人紅細(xì)胞上或血漿中分離出來[6]。再以100微升/只的人附紅細(xì)胞體分離純化液，經(jīng)腹腔注射，連續(xù)注射3天后，能成功的構(gòu)建感染人附紅細(xì)胞體SD大鼠模型。

1.實(shí)驗動物的選擇：復(fù)制感染人附紅細(xì)胞體的動物模型，首先遇到的問題就是模型動物的選擇。顧為望等[7]研究表明，F(xiàn)MMU白化豚鼠有獨(dú)特的免疫學(xué)特性,紅細(xì)胞免疫功能低,對人附紅細(xì)胞體敏感。但經(jīng)過反復(fù)的預(yù)實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)家兔、豚鼠、大鼠、小鼠、裸鼠均存在普遍的附紅細(xì)胞體自然感染。最終選取SD大鼠作為造模動物，原因如下：首先在反復(fù)的預(yù)實(shí)驗中,SD大鼠是附紅細(xì)胞體自然感染率相對低的實(shí)驗動物；其次倪婷婷等[8]描述了以豬陽性血液感染切除脾臟的昆明小鼠的方式建立小鼠感染模型，相比較大鼠具有體型大小合適、操作方便、血量相對充裕的優(yōu)點(diǎn)，可以克服因小鼠血量少，而不能滿足實(shí)驗過程中反復(fù)測量實(shí)驗指標(biāo)的弊端；最后，模型動物選用SD大鼠，本身也具有經(jīng)濟(jì)適用的優(yōu)勢。

2.感染途徑的選擇:復(fù)制感染人附紅細(xì)胞體的動物模型，感染途徑的選擇可有腹腔注射、皮下接種、接觸感染等[9]。經(jīng)過反復(fù)的預(yù)實(shí)驗，最終選取腹腔注射附紅細(xì)胞體分離純化液的方法，主要考慮腹腔注射的感染途徑，不但操作簡便易行，而且還擁有實(shí)驗更客觀，容易干預(yù)，實(shí)驗周期短的特點(diǎn)。

3.注射劑量及濃度的選擇:對于分離純化液的注射量以及濃度的制定，經(jīng)預(yù)實(shí)驗摸索及正式實(shí)驗驗證，采用100微升/只，連續(xù)3天給藥，即可成功感染SD大鼠。但這僅是一個相對好操作的劑量，還在很多需要研究探討的地方，例如：能夠成功感染SD大鼠的最小劑量或最佳劑量；能夠出現(xiàn)人附紅細(xì)胞體病臨床表現(xiàn)的最佳劑量等雖然以附紅細(xì)胞體分離純化液作為感染源，相對于利用全血作為感染源而言更純凈，但同樣也存在收集大量附紅細(xì)胞體患者的血樣耗時長的缺陷。若能完善人附紅細(xì)胞體的體外培養(yǎng)體系，就能更快捷的獲取人附紅細(xì)胞體，必將有利于該病模型的獲取及發(fā)病機(jī)制的深入研究。

4.感染人附紅細(xì)胞體SD大鼠模型的感染率：復(fù)制感染人附紅細(xì)胞體的動物模型，模型組于感染第3天血涂片出現(xiàn)人附紅細(xì)胞體；感染第7天，感染率達(dá)到最高并伴發(fā)體溫升高、脫毛等臨床癥狀。感染第11天，雖然感染率沒有繼續(xù)上升，但有4只模型組SD大鼠出現(xiàn)鞏膜黃染，明顯脫毛的現(xiàn)象，占模型組總數(shù)的26.67%，說明已經(jīng)成功復(fù)制了感染人附紅細(xì)胞體的SD大鼠模型，并且在此模型的基礎(chǔ)上可進(jìn)一步研究探討關(guān)于人附紅細(xì)胞體病對機(jī)體代謝方面的影響機(jī)制。

5.需要進(jìn)一步研究的問題：(1)造模成功的SD大鼠的感染率與臨床癥狀(如飲食差、脫毛等)是否存在相關(guān)性，還需進(jìn)一步驗證。其次對4只模型組出現(xiàn)鞏膜黃染的SD大鼠，進(jìn)一步檢測時，發(fā)現(xiàn)其血糖顯著降低，直接膽紅素和總膽紅素升高，是個體差異還是有統(tǒng)計學(xué)意義，還需進(jìn)一步的實(shí)驗證實(shí)。(2)造模成功的SD大鼠，感染第7天、第9天、第11天感染率雖然維持在60%以上，但不再繼續(xù)上升的原因以及是否需要延長實(shí)驗時間，需要開展進(jìn)一步的實(shí)驗驗證。