成纖維細(xì)胞生長因子-21通過抑制EMT改善糖尿病腎纖維化

翁曉璐 林孫東 倪永青 何露露 盧學(xué)勉

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約40%的DN患者都會(huì)發(fā)展為終末期腎病(ESRD)[1,2]。進(jìn)行性的腎臟纖維化過程是DN的發(fā)展特點(diǎn)，基質(zhì)蛋白的過表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度積累是其重要原因，其中結(jié)締組織生長因子(CTGF)，纖連蛋白1(FN1)和膠原蛋白(Col)都參與了這一過程[3,4]。研究表明，ECM沉積主要由上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)誘導(dǎo)，EMT是一種上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為運(yùn)動(dòng)間充質(zhì)細(xì)胞的過程，上皮細(xì)胞在維持正常腎結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用[5]。在EMT期間，上皮細(xì)胞逐漸失去頂端-基底極性后和細(xì)胞內(nèi)粘連，同時(shí)獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型。該過程的特點(diǎn)表現(xiàn)在特異性上皮蛋白表達(dá)降低，包括E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和緊密連接蛋白-1(ZO-1)，隨后是間充質(zhì)特異性蛋白的表達(dá)增加，包括α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α- SMA)、波形蛋白(vimentin)和層粘連蛋白(laminin)。此外，有研究表明，抑制腎臟中EMT可顯著改善腎纖維化并且遏制DN的發(fā)展[5]。

成纖維細(xì)胞生長因子21(fibroblast growth factor, FGF21)是一種重要的代謝調(diào)節(jié)因子，研究報(bào)道FGF21在多種糖尿病并發(fā)癥中發(fā)揮了有益的生物學(xué)效應(yīng)[6,7]。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21干預(yù)能有效預(yù)防1型和2型糖尿病誘導(dǎo)的早期腎細(xì)胞凋亡及后期DN[4]。雖然在前期研究中發(fā)現(xiàn)FGF21干預(yù)能抑制糖尿病腎臟中CTGF的表達(dá)，但CTGF只是分子層面表征腎纖維化的多種標(biāo)志物之一。僅以此為基礎(chǔ)推斷FGF21在DN小鼠的腎臟中發(fā)揮抗纖維化作用，結(jié)論不充分。因此，本研究通過多次小劑量STZ腹腔注射誘導(dǎo)1型糖尿病并制備糖尿病腎臟纖維化模型用以考察FGF21干預(yù)能否通過抑制EMT過程，降低腎臟中ECM過度積聚，最終預(yù)防1型糖尿病DN腎纖維化的發(fā)生，以此為防治1型DN找到新的分子機(jī)制。

材料與方法

1.材料與試劑：C57BL/6J小鼠購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所,STZ購自美國Sigma公司，F(xiàn)GF21購自溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，血清和尿液腎功能試劑盒分別購自美國BioAssay Systems公司和美國BioAssay Systems公司，抗體結(jié)締組織生長因子(CTGF)、纖連蛋白1(FN1)、Ⅰ型纖溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)、膠原蛋白Ⅰ(Col Ⅰ)、膠原蛋白Ⅱ(Col Ⅱ)、膠原蛋白Ⅳ(Col Ⅳ)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、磷酸化鈣黏蛋白(p-cad)、足細(xì)胞裂孔膜蛋白(nephrin)、緊密連接蛋白-1(ZO-1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)及層粘連蛋白(laminin)均購自美國Cell Signaling公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，Nanodrop 2000光譜儀由美國Thermo Fisher Scientific提供，Stratagene MX3000p熱循環(huán)儀由美國Agilent StrataGene公司提供，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國PE Applied Biosystems公司。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理：32只8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為:正常對照組(Con組)、FGF21組(FGF21組)、糖尿病組(DM組)和治療組(DM/FGF21組)。連續(xù)5日利用鏈脲佐菌素(STZ)(溶于10mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液，pH值4.5)多次小劑量(50mg/kg)腹腔注射DM組和DM/FGF21組小鼠，最后一次注射后7天尾靜脈取血，檢測血糖水平，超過250mg/dl即認(rèn)定成模，對照組注射相同體積的溶媒(檸檬酸鹽緩沖液，pH值4.5)。成模后按分組給予FGF21腹腔注射處理4個(gè)月[100μg/(kg·d)]。記錄小鼠血糖和體重。 處死小鼠后，收集血清后檢測各組小鼠脛骨長、腎重、腎功能水平、腎臟纖維化情況、與ECM相關(guān)纖維化指標(biāo)以及EMT生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。

3.腎功能檢測：成模4個(gè)月后使用代謝籠收集小鼠24h尿液，收集后的尿液于1400r/min離心15min(4℃)，分離保存上清，并記錄相應(yīng)體積。應(yīng)用試劑盒對尿液及處死小鼠后收集的血清檢測多項(xiàng)腎功能指標(biāo)包括尿蛋白、尿微量白蛋白、尿肌酐、尿蛋白、尿微白蛋白、血清肌酸酐，血尿素氮及尿白蛋白/尿肌酐。

4.組織學(xué)染色：將小鼠腎組織在室溫下于10%甲醛溶液中固定48h。脫水后進(jìn)行石蠟包埋，切成4mm厚的塊，根據(jù)說明書，用蘇木精-伊紅(HE)染色進(jìn)行一般形態(tài)學(xué)檢查，糖原(PAS)染色評估腎小球硬化，天狼星紅(Sirius Red)染色和Masson三色染色評估代表纖維化的膠原蛋白的累積[7～9]。

5.RNA分離和定量QPCR的檢測：使用TRIzol試劑從腎組織分離總RNA，Nanodrop 2000光譜儀定量每個(gè)樣品中總mRNA的濃度后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將mRNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用QPCR定量各纖維化指標(biāo)的表達(dá)水平，通過比較CT方法計(jì)算mRNA的量。

6.Western blot法檢測：將腎組織在裂解緩沖液中勻漿，隨后4℃，12000×g離心15min，留取上層清亮部分。在10%SDS-PAGE電泳上分離每個(gè)等量蛋白質(zhì)的樣品并電流轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上。在室溫下，膜于脫脂牛奶中封閉1h后，在4℃下一抗孵育過夜：CTGF、FN1、PAI-1、ColⅠ、Col Ⅱ、Col Ⅳ、E-cadherin、p-cad、nephrin、ZO-1、α-SMA、vimentin、laminin 在含有0.05%Tween 20的Tris緩沖鹽水中洗滌3次后，將膜在室溫下二抗孵育1h。最后，發(fā)光液曝光并使用Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析。

結(jié) 果

1.FGF21干預(yù)改善腎臟肥大及腎臟功能紊亂：糖尿病小鼠腎臟重量與脛骨長度的比率顯著增加，糖尿病組小鼠尿量、尿蛋白含量、血肌酐水平、尿微量白蛋白水平、血尿氮水平和尿白蛋白/尿肌酐比率均增加。但給予FGF21干預(yù)后可顯著改善腎肥大和腎臟功能紊亂(表1)。

表1 FGF21干預(yù)對DN小鼠腎功能的影響

與Con組比較，*P<0.05;與DM組比較，#P<0.05

2.FGF21干預(yù)可改善糖尿病腎臟的腎小球硬化和纖維化：蘇木精-伊紅染色(HE染色)和糖原染色(PAS染色)結(jié)果顯示，糖尿病組小鼠腎臟病理改變明顯，表現(xiàn)為腎小管萎縮、腎小管間質(zhì)病變、腎小球擴(kuò)張、腎小球硬化、系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生、系毛細(xì)血管擴(kuò)張，而FGF21干預(yù)4個(gè)月后顯著保護(hù)糖尿病小鼠腎臟的結(jié)構(gòu)。此外，天狼星紅染色和Masson染色顯示，糖尿病組小鼠腎小球和腎小管中明顯的膠原蛋白積聚，而4個(gè)月的FGF21干預(yù)抑制了糖尿病誘導(dǎo)的腎纖維化,詳見圖1。

圖1 FGF21干預(yù)對DN小鼠腎臟病理改變和纖維化的影響(×200)A.蘇木精-伊紅染色;B.糖原染色;C.天狼星紅染色；D.Masson染色。A～D顯示腎小球硬化和膠原沉積，黑色箭頭表示上述病理改變；E.系膜基質(zhì)參數(shù)；F.天狼星紅染色分析參數(shù)；G.Masson染色分析參數(shù)。E～G分別為對糖原染色、天狼星紅染色和Masson染色切片進(jìn)行腎小球硬化和膠原蛋白累積的半定量分析。與Con組比較，*P<0.05;與DM組比較，#P<0.05

3.FGF21干預(yù)抑制腎臟中ECM累積相關(guān)的糖尿病腎纖維化：糖尿病組小鼠的CTGF(ECM合成的強(qiáng)誘導(dǎo)物)的表達(dá)以及經(jīng)典基質(zhì)蛋白的表達(dá)，包括FN1，Ⅰ型膠原，Ⅱ型膠原和Ⅳ型膠原均顯著增加，且被認(rèn)為是炎癥和纖維化標(biāo)志物的PAI-1的表達(dá)也明顯上調(diào)。此外，QPCR測定顯示，糖尿病組中上述ECM標(biāo)志物的mRNA水平也增加。 而在FGF21干預(yù)4個(gè)月后顯著抑制了糖尿病腎臟中ECM mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)(P<0.05，圖2)。

圖2 FGF21對糖尿病腎臟中ECM和腎纖維化標(biāo)志物的mRNA表達(dá)的影響A～D為腎臟中ECM沉積相關(guān)的經(jīng)典標(biāo)志性蛋白表達(dá)水平(A.FN1;B.Col Ⅰ;C.Col Ⅱ;D.Col Ⅳ)。E、F為腎纖維化和炎性反應(yīng)的多種標(biāo)志物的蛋白表達(dá)水平(E.CTGF；F.PAI)。G～L為通過qPCR獲得的上述標(biāo)志物相應(yīng)mRNA水平(G.FN1；H.Col Ⅰ；I.Col Ⅱ；J.Col Ⅳ；K.CTGF；L.PAI)。與Con組比較，*P<0.05;與DM組比較，#P<0.05(n=8)

4.FGF21抑制糖尿病腎臟中的EMT。如圖3所示，糖尿病組小鼠的EMT顯著增強(qiáng)(P<0.05)，體現(xiàn)在E-cadherin和ZO-1的表達(dá)降低，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)增加，包括α-SMA、vimentin和 lamini。通過FGF21干預(yù)4個(gè)月后，抑制了上述EMT過程(P<0.05)。FGF21誘導(dǎo)的糖尿病腎臟對EMT的預(yù)防作用與抑制負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Snail、Twist和Slug有關(guān)。在治療組中，來源于足細(xì)胞的P-cadherin的在腎臟中表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，而糖尿病組中Nephrin表達(dá)在腎臟中明顯下調(diào)(P<0.05)。

圖3 FGF21對DN小鼠腎臟中EMT過程的表達(dá)的影響A～C為E-cadherin的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的蛋白表達(dá)水平(A.Snail；B.Twist；C.Slug)。D～I(xiàn)為EMT過程的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平(E.E-cadherin；F.ZO-1；G.α-SMA；H.vimentin；I.Laminin)。J、K為來源于腎小球的黏附蛋白表達(dá)水平(J.P-cadherin；K.Nephrin)。與Con組比較，*P<0.05;與DM組比較，#P<0.05(n=8)

討 論

FGF21是FGF家族的成員，其在多個(gè)器官中以內(nèi)分泌方式發(fā)揮有益生物學(xué)作用[10]。 越來越多的臨床研究表明，患有各種腎病包括慢性腎病(CKD)、腎移植、ESRD、早期糖尿病腎病以及急性腎功能不全在內(nèi)的患者血液循環(huán)中的FGF21水平顯著增加，表明FGF21高于基礎(chǔ)水平是腎臟保護(hù)的一種應(yīng)激反應(yīng)[11～16]。該結(jié)論研究顯示在患有CKD的小鼠中給予FGF21可維持腎功能。前期研究證實(shí)FGF21給予可預(yù)防DN，但FGF21缺失會(huì)加速DN的進(jìn)展[9,17]。筆者還發(fā)現(xiàn)FGF21干預(yù)抑制糖尿病腎臟中的CTGF表達(dá)[18]。 然而，CTGF只是纖維化標(biāo)志物之一，以此為基礎(chǔ)推斷不足以說明FGF21在DN小鼠腎臟中的抗纖維化作用，因此，需要進(jìn)行進(jìn)一步機(jī)制探索。

本研究采用多次小劑量(50mg/kg)在小鼠腹腔注射STZ的方法建立1型糖尿病模型。確定成模4個(gè)月后，小鼠出現(xiàn)腎功能受損和形態(tài)學(xué)異常，其特征為腎小管萎縮、腎小管間質(zhì)病變、腎小球擴(kuò)張、腎小球硬化、系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生、及毛細(xì)管擴(kuò)張、塌陷。同時(shí)，在天狼星紅染色和Masson染色發(fā)現(xiàn)，纖維化也明顯出現(xiàn)在腎小管和腎小球區(qū)域。通過糖原染色發(fā)現(xiàn)，在DM中腎小球硬化十分明顯。上述結(jié)果表明在糖尿病腎臟中，腎小管和腎小球均發(fā)生纖維化。此外，糖尿病腎臟中多種纖維化指標(biāo)的上調(diào)和ECM標(biāo)志物表達(dá)水平的增加也進(jìn)一步證實(shí)了腎臟纖維化的演變。然而，通過4個(gè)月的FGF21干預(yù)顯著抑制了上述所有現(xiàn)象，表明FGF21在DN小鼠的腎中發(fā)揮了抗纖維化作用。

研究表明，EMT在腎臟硬化和ECM積聚中起著重要作用，這是糖尿病腎病的標(biāo)志[5]。EMT可根據(jù)其發(fā)生的不同生物環(huán)境和相關(guān)結(jié)果分為3種不同類型， 1型EMT發(fā)生在胚胎開始和器官發(fā)育期間，這是器官重塑和器官進(jìn)化所必要的過程，并且它的發(fā)生不誘導(dǎo)炎癥、纖維化和惡性轉(zhuǎn)移。2型EMT發(fā)生能在器官纖維化和組織再生過程，并誘導(dǎo)活化間充質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生、刺激ECM積聚，最終導(dǎo)致組織損傷。3型EMT一般在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移期間發(fā)生，并且與腫瘤轉(zhuǎn)移所需的癌細(xì)胞基因組和染色體的變化相關(guān)。而在糖尿病腎病中EMT屬于2型EMT，其被認(rèn)為是糖尿病腎纖維化的誘導(dǎo)物。本研究結(jié)果顯示，糖尿病腎臟中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和ZO-1的表達(dá)下降，以及間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、Vimentin、Laminin表達(dá)的上調(diào)，表明在糖尿病腎臟中EMT過程活躍。同時(shí)，腎小球中的EMT在誘導(dǎo)足細(xì)胞丟失和腎小球損傷方面也起著重要作用[19,20]，在本研究中觀察到足細(xì)胞的特異性標(biāo)志物p-cad和Nephrin的表達(dá)降低。而所有上述EMT標(biāo)志物的表達(dá)通過給予FGF21可得到反向有益調(diào)節(jié)，表明FGF21在糖尿病腎病的腎小管和腎小球中對EMT的發(fā)揮抑制作用。

綜上所述，F(xiàn)GF21干預(yù)能通過抑制上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程，減少細(xì)胞外基質(zhì)在腎內(nèi)的積聚，從而減輕糖尿病導(dǎo)致的腎臟纖維化，為防治1型DN提供了新的理論依據(jù)。