血清反復凍融對腎功能指標檢測結果的影響

劉佳佳，石蓮花，金有訓，陳 燕，呂 虹，張國軍，康熙雄

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院實驗診斷中心，北京100070；2.中國計量科學研究院，北京100029；3北京市免疫試劑臨床工程技術研究中心，北京100070）

檢測血清、血漿等血液樣本中的生物活性分子是臨床檢驗和醫(yī)學研究的重要內(nèi)容，樣本分析前階段包括樣本處理和存儲是影響檢測結果的關鍵部分［1-2］。研究［3-4］表明，當?shù)蜏乩鋬鰞Υ鏁r血清中各成分是較穩(wěn)定的，為保持生物活性分子最好的性能，最好是解凍并且只使用一次來防止重復凍融對檢測結果的影響，這是因為反復凍融可能導致血清標本中生物分子的降解、活性的改變和不溶性沉淀物的產(chǎn)生。然而，在臨床工作或科研中，有時樣本多次凍融是不可避免的，這可能與樣本復查或者對重新凍結的樣本進行額外的分析有關。血清中的各種成分對反復凍融的次數(shù)可能有不同的耐受性，這一問題的相關研究數(shù)據(jù)有限，發(fā)表的論文往往不具備高的統(tǒng)計能力。因此，我們在嚴格質量控制前提下進行了本研究，提供了關于不同儲存溫度反復凍融對30例血清中腎功能相關生化指標（血肌酐、尿素氮、尿酸）結果的影響。

材料和方法

1 一般資料

1.1 樣本來源 樣本來源于首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院門診就診患者空腹靜脈血，全部為分離膠采血管真空采血，采集后的血液室溫保存不超過1 h，2000 r/min離心5min，將血清與血細胞分離。血清肉眼觀非脂血、高膽紅素血和溶血。

1.2 試劑來源 CREA、BUN、UA檢測試劑盒由日立公司提供。

1.3 儀器設備 日立LABO SPECT 008生化分析儀，高速低溫離心機，-20℃冷凍冰箱，-80℃冷凍冰箱等。

2 方法

收集肉眼觀非脂血、高膽紅素血和溶血的血清樣本30例并編號，立即對CREA、BUN、UA濃度進行檢測（原始水平），測定后將每例樣本分2份分裝于5mL試管中，并用封口膜進行封口，防止血清樣本蒸發(fā)，分別直立放入-80℃、-20℃冰箱中冷凍保存，2 h后再解凍復融，將樣本反復混勻，去掉封口膜，2000 r/min離心5min后上機對CREA、BUN、UA復測。檢測完成后再將標本用封口膜封口，各放入-80℃、-20℃冰箱中凍存，如此反復凍存5次。將-80℃、-20℃不同凍融次數(shù)后CREA、BUN、UA濃度檢測結果（T1～T5）與原始水平（T0）進行比較，同時計算每例樣本相對于原始水平變化百分比，計算公式為：（Cn-C0）/C0×100%，其中Cn表示該樣本凍融第n次時檢測指標的濃度，C0表示該樣本的原始濃度。本研究中的3個檢測指標均有低、中、高三個水平質控品隨之檢測，以保證檢測數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。

3 統(tǒng)計學處理

原始數(shù)據(jù)記錄于Excel表格中，各組數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗，均為非正態(tài)性分布，實驗結果采用中位數(shù)（四分位數(shù)范圍）［M（P25～P75）］表示。采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，同一檢測指標不同組間濃度比較采用相關變量非參數(shù)Friedman檢驗，有統(tǒng)計學差異者進行配對樣本W(wǎng)ilcoxon檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 質控血清測試結果

3個指標（CREA、BUN、UA）的質控血清隨樣本各自進行測試，批間變異系數(shù)＜5%（見表1）。

表1 各成分檢測方法及質控血清測試結果

2 血清凍融前后各指標濃度變化分析

30例樣本在-80℃冰箱儲存貯反復凍融5次后CREA、BUN、UA均發(fā)生明顯變化，F(xiàn)riedman檢驗表明差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝101.68，P＜0.05；χ2＝113.13，P＜0.05；χ2＝128.91，P＜0.05）。經(jīng)配對Wilcoxon檢驗，第2次復融后CREA、BUN、UA檢測結果與初始水平相比均差異有統(tǒng)計學意義（Z＝-4.09，P＜0.05；Z＝-3.13，P＜0.05；Z＝-2.70，P＜0.05）。-20℃冰箱凍存的血清樣本5個凍融循環(huán)后CREA與UA較穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯的升高或降低（χ2＝9.42，P＝0.093；χ2＝10.74，P＝0.057），而BUN的濃度發(fā)生了改變（χ2＝45.09，P＜0.05），經(jīng)配對Wilcoxon檢驗，經(jīng)過2次解凍后BUN檢測值較原始水平即發(fā)生了顯著性變化（Z＝-3.46，P＝0.001），見表2、表3，圖1。

表2 血清-80℃凍融前后腎功能指標濃度變化［M（P25～P75）］

表3 血清-20℃凍融前后腎功能指標濃度變化［M（P25～P75）］

圖1 血清在-80℃、-20℃冰箱凍融前后腎功能實驗室指標濃度改變（%）

討 論

血清中生物活性分子（包括蛋白質、代謝物、離子等）的變化可以反映人體動態(tài)健康狀態(tài)，某些分子可作為疾病診斷或預后的生物標志物［5-6］。腎臟疾病是臨床常見病，種類較多，各種腎臟疾病均可造成機體物質代謝紊亂以及體液生物化學的改變［7-8］。腎功能常用生化檢測指標（CREA、BUN、UA）能夠反映腎小球濾過功能并估計損害程度，是發(fā)現(xiàn)腎功能改變的重要指標，對于早期干預、防止腎功能進入到終末期、監(jiān)測腎毒性藥物的不良反應至關重要［9-11］。因此，腎功能指標檢驗在臨床應用越來越普遍。一些基層實驗室標本量不多，可能不會做到即時檢驗，加之樣本結果日后復查或用于科學研究，因此，樣本檢測結果可能會受到額外的反復凍融的影響［12］。

試劑廠商一般都提醒避免反復凍融血清，并建議對血清進行分裝凍存［13］。關于血標本凍融對生物活性分子檢測水平的影響，國內(nèi)外早有報道。司學眾等［14］的研究顯示，樣本凍融2次后，血甲狀腺功能指標，包括TSH、TT3、TT4、FT3、FT4發(fā)生顯著改變。CUHADAR等［15］研究了血清凍融1～10次后各生化成分改變，結果顯示，在-20℃凍存條件下，血清凍融10次后AST、ALT、GGT、HDL膽固醇、葡萄糖、肌酐未見顯著性變化，而白蛋白在凍融7次后發(fā)生顯著升高，尿素氮和鈣離子在3次凍融后發(fā)生改變，總蛋白和尿酸是最不穩(wěn)定的，分別在凍融1次和2次即發(fā)生改變。Hillebrand等［16］對血漿和血清中內(nèi)分泌相關參數(shù)進行分析發(fā)現(xiàn)，-20℃下凍存的標本2個凍融循環(huán)后血漿腎素活性升高，經(jīng)過3個凍融循環(huán)促腎上腺皮質激素（ACTH）濃度發(fā)生顯著下降，而其他參數(shù)包括甲狀腺素、胰高血糖素、促甲狀腺素、甲狀腺素結合球蛋白等經(jīng)過3次凍融循環(huán)未發(fā)生明顯改變。以上研究表明，血清凍融對不同蛋白質、電解質、細胞因子等的影響不同。

本文通過對30例血清樣本凍融5次連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，-80℃凍存的血清樣本經(jīng)過1個凍融循環(huán)后BUN檢查結果與基準水平值比較差異即有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），反復凍融2次以上的血清樣本CREA、BUN、UA檢測結果與基準水平相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 -20℃凍存的血清標本經(jīng)過1次凍融循環(huán)后BUN檢測值發(fā)生顯著性改變（P＜0.05），而CREA和UA較穩(wěn)定，5次凍融循環(huán)后未出現(xiàn)明顯的升高或降低。根據(jù)質控結果，本研究標本測定結果穩(wěn)定且可靠。

結合歷史文獻報道以及本研究結果，可以認為反復凍融對血清中腎功能指標結果會產(chǎn)生影響，但這些分子對不同存儲溫度及反復凍融次數(shù)的耐受力不同。BUN是其中最不穩(wěn)定的分子，應避免凍存后檢測。對于CREA和UA而言，在-80℃下存儲時的血清標本應進行分裝，冷凍的血清樣本應該解凍一次以保持最佳的性能；在-20℃冰箱中冷凍的血清受凍融循環(huán)影響較小，在5次以內(nèi)凍融情況下，可以不對血清進行分裝保存。本實驗有利于指導標本的保存和復查工作，提示臨床檢驗者和科研工作者應避免凍融循環(huán)對檢測結果的影響，以保證實驗結果的準確性。至于更多次凍融循環(huán)對血清腎功能實驗室指標的影響以及凍融次數(shù)對其他血清中生物活性分子的影響，還有待繼續(xù)研究。