EB病毒核酸定量檢測試劑性能驗(yàn)證及評價(jià)

曲 沛，郭 杰，徐新民，焦炳欣，郭晶晶，方 茜，王雅杰

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院，北京100015）

EB病毒（EBV）又稱人類皰疹病毒4型，可引起傳染性單核細(xì)胞增多癥，并與鼻咽癌、NPC伯基特Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤及多發(fā)性硬化癥的發(fā)生關(guān)系密切［1-2］。因此EB病毒的檢測對于相關(guān)疾病的診斷和預(yù)后都具有非常重要的意義。本研究通過對EB病毒定量核酸檢測系統(tǒng)的性能驗(yàn)證，以評估EB病毒定量檢測試劑的分析性能及其臨床應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

1 標(biāo)本來源

標(biāo)本收集來源于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院檢驗(yàn)科不同濃度的臨床全血標(biāo)本及已知濃度臨床檢驗(yàn)中心質(zhì)控品（批號為20180412），于-20℃冰箱保存。

2 儀器與試劑

儀器：宏石SLAN-96P。試劑：圣湘EB病毒核酸定量檢測試劑（批號2017007）及配套的核酸提取純化試劑盒。

3 性能驗(yàn)證指標(biāo)及驗(yàn)證方法

根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WS/T）492-2016文件進(jìn)行精密度和準(zhǔn)確性驗(yàn)證。

3.1 準(zhǔn)確性 測定來自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供的已知濃度的室間質(zhì)控品，其濃度水平覆蓋檢測方法的可報(bào)告范圍，連續(xù)檢測2次，計(jì)算均值（±s）和偏倚，用以驗(yàn)證試劑盒的準(zhǔn)確性。

3.2 精密度 批內(nèi)精密度：選擇濃度為106IU/mL和103IU/mL的臨床全血樣本各1例，在同一批實(shí)驗(yàn)中重復(fù)測定20次；批間精密度：將高、低濃度106IU/mL和103IU/mL兩個(gè)水平的標(biāo)本，在同一批試驗(yàn)中重復(fù)檢測5次，連續(xù)檢測4 d，每個(gè)水平共收集20個(gè)數(shù)據(jù)；如果出現(xiàn)失控，則應(yīng)刪除數(shù)據(jù)并重新測定。分別統(tǒng)計(jì)兩個(gè)水平標(biāo)本檢測值的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，再計(jì)算CV值。

3.3 線性范圍 選擇臨床5.94×106IU/mL的全血樣本，提取好后用核酸釋放劑按10倍梯度稀釋至101，對高值陽性標(biāo)本和稀釋后的標(biāo)本進(jìn)行同批次檢測，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)檢測3次，對測定值和理論值進(jìn)行線性回歸分析，要求滿足b在1+0.05范圍內(nèi)，a接近于0，R2≥0.95［3-4］。

結(jié) 果

1 準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果

用來自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供的已知濃度的室間質(zhì)控品進(jìn)行準(zhǔn)確性驗(yàn)證，計(jì)算其均值和偏倚，所有樣本均達(dá)到偏倚≤7.5%的標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確性驗(yàn)證符合要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄見表1。

表1 準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果

2 精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.1 批內(nèi)精密度驗(yàn)證結(jié)果 采用濃度范圍為106IU/mL和103IU/mL的高、低兩個(gè)水平臨床樣本，在同一批試驗(yàn)中重復(fù)檢測20次；分別統(tǒng)計(jì)兩個(gè)水平標(biāo)本檢測值的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，再計(jì)算CV值。高低濃度對數(shù)值的變異系數(shù)分別為0.58%和2.3%，均符合CNAS-CL36規(guī)定的CV≤5%的要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄見表2。

表2 批內(nèi)精密度驗(yàn)證結(jié)果

續(xù)表

2.2 批間精密度驗(yàn)證 采用濃度范圍為106IU/mL和103IU/mL的高、低兩個(gè)水平臨床樣本各1例進(jìn)行批間精密度的驗(yàn)證。分別統(tǒng)計(jì)兩個(gè)水平標(biāo)本檢測值的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，再計(jì)算CV值。高低濃度對數(shù)值的變異系數(shù)分別為2.25%和0.49%，均符合CNAS-CL36規(guī)定的CV≤5%的要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄見表3。

表3 批間精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.3 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果 將高值陽性標(biāo)本6.58×106IU/mL梯度稀釋至6.58×10IU/mL，結(jié)果如表4和圖1所示，實(shí)際值和理論值的回歸方程是Y＝1.015X-0.0563（R2＝0.9996≥0.98），滿足b在1+0.05范圍內(nèi)，a接近于0，R2≥0.95，線性范圍為6.58×10～6.58×106IU/mL。試劑說明書的定量線性范圍為4.00×102～4.00×109IU/mL，驗(yàn)證合格。

表4 線性驗(yàn)證結(jié)果

圖1 線性回歸方程

討 論

EB病毒是一種嗜B淋巴細(xì)胞的人類皰疹病毒，屬于DNA病毒的一種，具有傳染性強(qiáng)和潛伏感染的特點(diǎn)。EBV感染后，30%的患者可出現(xiàn)咽峽部溶血性鏈球菌感染，13%的患者發(fā)生急性腎炎，6%的患者發(fā)生心肌炎，1%的患者發(fā)生腦炎。部分患者因并發(fā)脾破裂、腦膜炎、心肌炎、肺炎、繼發(fā)感染而死亡［5］。

自1999年KIMURA等［6］首先發(fā)表EB病毒RT PCR檢測方法以來，至少有25個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室開發(fā)出不同的檢測方法，在美國、歐洲和中國至少有10種商業(yè)EBV-DNA檢測PCR試劑盒在銷售，國際上報(bào)道的定量和半定量的檢測結(jié)果單位各不相同，對EBV的研究工作造成了一定的影響［7］。

因?yàn)镽T-PCR技術(shù)定量結(jié)果的影響因素眾多，包括目的基因的選取、引物和探針的設(shè)計(jì)，PCR設(shè)備、預(yù)混酶試劑的成分、PCR循環(huán)數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)品的選擇等多個(gè)方面，目前由于各研究中心間方法學(xué)的差異，因此見諸報(bào)道的定量結(jié)果差異極大。2011年WHO發(fā)布首個(gè)EBV-DNA檢測的國際標(biāo)準(zhǔn)，使得不同國家、不同實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果具有可比性，起到積極的作用［8］。

本文通過對EBV定量檢測試劑的精密度、準(zhǔn)確性及線性范圍進(jìn)行驗(yàn)證，評估試劑的分析性能。驗(yàn)證結(jié)果表明，在3.8×103IU/mL和1.35×106IU/mL濃度范圍具有較好的批內(nèi)精密度和批間精密度，符合CNAS-CL36的要求；在7.74×10～6.71×106IU/mL分析測量范圍線性關(guān)系良好。

為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，參考GB/T22576-2008標(biāo)準(zhǔn)，明確了臨床實(shí)驗(yàn)室在使用廠家的檢驗(yàn)方法和試劑盒時(shí)，還要驗(yàn)證相關(guān)的分析性能，以證實(shí)本實(shí)驗(yàn)室能否達(dá)到的廠家聲稱的分析性能指標(biāo)。依據(jù)GLIA88要求，臨床實(shí)驗(yàn)室可只對下面三項(xiàng)主要分析性能進(jìn)行驗(yàn)證：準(zhǔn)確性、精密度、線性范圍。

研究結(jié)果顯示試劑盒的準(zhǔn)確性高，精密度好，線性范圍符合說明書要求，參考區(qū)間有效，能夠滿足臨床檢驗(yàn)的需求。