熒光標(biāo)記MOMP抗體檢測(cè)沙眼衣原體的方法及性能評(píng)價(jià)

劉小平，樊尚榮，陳曉明，黃 榮，閆津津

（1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳518036；2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 深圳518036；3.深圳邁克龍生物技術(shù)有限公司，廣東 深圳518057；4.南方大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳518110）

沙眼衣原體（chlamydia trachomatis）是侵犯人類眼結(jié)膜、角膜和生殖道粘膜的病原體?？梢鸾Y(jié)膜炎、角膜炎。通過(guò)性傳播引起男性尿道炎、附睪炎，女性宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、輸卵管炎，導(dǎo)致輸卵管性不孕、異位妊娠、自然流產(chǎn)、早產(chǎn)和胎膜早破等，且可發(fā)生母嬰傳播，造成新生兒的包涵體性結(jié)膜炎和衣原體肺炎。目前用于臨床的檢驗(yàn)方法有微生物學(xué)檢測(cè)方法、免疫學(xué)方法、核酸檢測(cè)等［1-6］，所用試劑以進(jìn)口為主［7-11］。本文建立了一種用異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記沙眼衣原體主要外膜蛋白單克隆抗體通過(guò)直接免疫熒光（direct immunofluorescence assay，DFA）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)生殖道感染沙眼衣原體的方法，現(xiàn)介紹如下。

材料與方法

1 材料

1.1 一般資料 標(biāo)本采集于婦科門診1個(gè)月內(nèi)未使用抗生素、宮頸無(wú)肉眼可見的膿性分泌物患者。

1.2 宮頸分泌物樣本采集 用滅菌拭子拭去宮頸口黏性分泌物，丟棄；用另一滅菌拭子插入宮頸管2～3厘米處緩緩轉(zhuǎn)動(dòng)一周、約10～15s抽出，抽出拭子時(shí)應(yīng)避免接觸到陰道壁。每例患者采集宮頸分泌物2支，分別編號(hào)。

1.3 樣本保存 取樣后如不能及時(shí)涂片或處理，樣本需放入2～8℃冰箱保存。

1.4 制片 取出后立即將拭子涂在直徑為8毫米的載玻片標(biāo)記圈內(nèi)?？諝庾匀桓稍锖螅脽o(wú)水乙醇將玻片標(biāo)本固定5min，待乙醇全部揮發(fā)后即可檢測(cè)或置-20℃冰箱保存待檢。

1.5 試劑 （1）異硫氰酸熒光素標(biāo)記沙眼衣原體主要外膜蛋白單克隆抗體（自制試劑）、細(xì)胞培養(yǎng)獲得ATCC 沙眼衣原體菌株的包涵體。ATCC CCL-2（HeLa）上皮細(xì)胞株。ATCC49226淋病奈瑟菌、分離株淋病奈瑟菌5株，ATCC29213金黃色葡萄球菌、分離株金黃色葡萄球菌5株、分離株無(wú)乳鏈球菌。磷酸緩沖鹽溶液（PBS），吐溫，營(yíng)養(yǎng)肉湯、去離子水等。（2）陽(yáng)性質(zhì)控物 滅活沙眼衣原體培養(yǎng)物。（3）陰性質(zhì)控物：ATCC CCL-2（HeLa）上皮細(xì)胞培養(yǎng)物。（4）沙眼衣原體DNA檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自中國(guó)廣東中山達(dá)安基因股份有限公司，國(guó)械注準(zhǔn)20163401027）。

1.6 儀器 熒光顯微鏡：蔡司Axioskop 2 plus熒光顯微鏡。

1.7 試驗(yàn)用其他器材 10uL移液器、標(biāo)記圈載玻片、水浴箱、濕盒、蓋片、甘油。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀（ABI 7500），離心機(jī)等。

2 方法

2.1 FITC標(biāo)記MOMP單克隆抗體制備過(guò)程

（1）用透析袋將MOMP單克隆抗體用碳酸鹽緩沖鹽4℃，透析16h。

（2）稱取少量的FITC粉末，用DMSO溶解至終濃度為10mg/mL。

（3）將透析過(guò)的抗體收集到干凈的離心管內(nèi)，按1mg抗體：10mg/mL FITC＝1∶6的比例混勻，在室溫避光的條件下，反應(yīng)2h。

（4）用透析袋將FITC標(biāo)記的MOMP單克隆抗體用PBS（7.4）緩沖液，4℃，透析過(guò)夜，除去游離的FITC，透析完成后，將抗體收集到干凈的離心管內(nèi)，避光，4℃保存。

2.2 陽(yáng)性質(zhì)控物的涂片制備

沙眼衣原體培養(yǎng)物：收集、純化沙眼衣原體，4℃10000RCF離心10min，棄上清。

吸取1ml甲醛添加到沉淀上，輕輕吹打混勻，放置10min后，4℃10000RCF離心10min，收集沉淀。沉淀低溫干燥后，用1mL生理鹽水溶解，留待制作試劑質(zhì)控物。

（1）稀釋

采用生理鹽水溶液對(duì)沙眼衣原體培養(yǎng)物稀釋。

（2）制片

用加樣槍分別吸20μL沙眼衣原體懸液均勻涂布在載玻片上。避免反復(fù)涂布、避免移液器吸頭破壞細(xì)胞包涵體/沙眼衣原體。

（3）固定

用乙醇固定10min，室溫干燥、備用。

2.3 檢測(cè)試劑的分析性能評(píng)價(jià)

運(yùn)用單一變量法，分別評(píng)價(jià)沙眼衣原體涂片介質(zhì)類型、試劑用量、反應(yīng)時(shí)間、孵育溫度、孵育濕度、沖洗用水對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。質(zhì)控涂片檢測(cè)采用已確定的最佳反應(yīng)條件。試驗(yàn)用菌株為沙眼衣原體培養(yǎng)株。

2.3.1 涂片介質(zhì)的選擇 試驗(yàn)菌株為自制陽(yáng)性質(zhì)控物，介質(zhì)類型包括生理鹽水、營(yíng)養(yǎng)肉湯、乙醇。分別用生理鹽水、營(yíng)養(yǎng)肉湯作為涂片介質(zhì)蘸取沙眼衣原體培養(yǎng)物滾動(dòng)制片各10張，自然干燥，其余步驟采用已確定的最佳反應(yīng)條件。

2.3.2 涂片介質(zhì)pH值 用1M乙酸稀釋溶液、生理鹽水、1M碳酸氫鈉溶液用于涂片介質(zhì)調(diào)整試驗(yàn)pH，在pH值＜7.0、pH值等于7.0和pH值＞7.0時(shí)制備沙眼衣原體菌株涂片各10片，自然干燥其余步驟采用已確定的最佳反應(yīng)條件。

2.3.3 試劑用量確定 制備沙眼衣原體涂片30片，自然干燥分別5μL、8μL、10μL沙眼衣原體免疫熒光試劑。

2.3.4 反應(yīng)時(shí)間 制備沙眼衣原體涂片30片，自然干燥后加入5μL沙眼衣原體免疫熒光試劑分別作用20min、30min和45 min，觀察結(jié)果。

2.3.5 孵育溫度和濕度 制備沙眼衣原體涂片各10片，加入沙眼衣原體免疫熒光試劑后分別放置在室溫（26～30℃）、37℃水浴，37℃培養(yǎng)箱、37℃保濕暗盒，30 min后沖洗、晾干、觀察結(jié)果。

2.3.6 沖洗用水 制備沙眼衣原體涂片各10片，加5μL沙眼衣原體免疫熒光試劑后分別放置在保濕暗盒37℃，30min后分別用自來(lái)水、去離子水和PBS+吐溫沖洗，觀察結(jié)果。

2.3.7 抗體特異性檢測(cè) 分析的菌株有：ATCC49226淋病奈瑟菌、淋病奈瑟菌分離株，ATCC29213金黃色葡萄球菌，無(wú)乳鏈球菌分離株。

2.3.8 結(jié)果判斷 在熒光顯微鏡下（10×100）有10個(gè)以上染成明亮蘋果綠色的原體、始體或細(xì)細(xì)胞內(nèi)包涵體為陽(yáng)性。

2.4 標(biāo)本檢測(cè) 在標(biāo)本載玻片加入5μL FITC標(biāo)記的主要外膜蛋白單克隆抗體，使其覆蓋整個(gè)孔，濕盒內(nèi)室溫反應(yīng)30min。取出后用緩沖液沖洗3次，每次30s，最后用去離子水沖洗1次。晾干，備檢。pH7.2甘油封片。

2.4.1 檢驗(yàn)方法 將樣本輕緩滾動(dòng)涂抹在載玻片圓圈內(nèi)，充分晾干，使用乙固定10min，自然晾干，滴加熒光標(biāo)記沙眼衣原體抗體，均勻涂布，置于37℃水浴箱孵育30min。應(yīng)避免試劑在玻片上干燥。孵育后，使用自來(lái)水緩緩沖洗玻片30s。將玻片吹干或自然晾干。

2.4.2 熒光顯微鏡進(jìn)行閱片 油鏡下（100×10）尋找發(fā)蘋果綠色熒光的典型圓球形沙眼衣原體顆粒，如不能馬上觀察樣本，建議將其置于2-8℃環(huán)境下避光保存。

結(jié)果判讀 觀察全片視野，累計(jì)發(fā)現(xiàn)10個(gè)及10個(gè)以上蘋果綠色典型圓球形沙眼衣原體顆粒即為陽(yáng)性。如標(biāo)本涂片中可見10個(gè)以上上皮細(xì)胞，未見到原體、始體熒光顆?；虬w，報(bào)告為陰性。

如標(biāo)本涂片中細(xì)胞少于10個(gè)且未見到衣原體熒光顆粒，則應(yīng)考慮標(biāo)本采集或涂片制作不當(dāng)所致。否則判定為陰性。若發(fā)現(xiàn)不典型的疑似結(jié)果以及不可解釋的結(jié)果時(shí)應(yīng)重新采集樣本進(jìn)行再次檢測(cè)。

2.4.3 質(zhì)量控制 質(zhì)控片與標(biāo)本片同樣染色過(guò)程，在熒光顯微鏡下，陽(yáng)標(biāo)本在紅色背景中有染成明亮蘋果綠色的原體、始體或細(xì)細(xì)胞內(nèi)包涵體。

2.5 沙眼衣原體DNA檢測(cè)（PCR-熒光探針法）

2.5.1 沙眼衣原體標(biāo)本和陰、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、DNA提取 標(biāo)本管內(nèi)加入1mL生理鹽水，充分震蕩、混勻，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管，15000rpm，15min，棄上清；沉淀加入1mL無(wú)菌生理鹽水混勻，12000轉(zhuǎn)/分離心5min，再重復(fù)一次。沉淀加入50uLDNA提取液，充分混勻，100℃干浴10min，12000rpm 離心5min，備用。陰性質(zhì)控品、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品同法處理。

2.5.2 PCR擴(kuò)增 取PCR反應(yīng)管，分別加入待測(cè)標(biāo)本提取物、質(zhì)控品2μL，蓋好離心管蓋，6500rpm離心數(shù)s。將反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀內(nèi)擴(kuò)增。按照以下程序擴(kuò)增：93℃預(yù)變性2min，然后按93℃、45s，55℃、60s先做10個(gè)循環(huán)，最后按93℃、30s，55℃、45s，做30個(gè)循環(huán)。熒光采集點(diǎn)為55℃、45s。

2.5.3 質(zhì)量控制 每次試驗(yàn)必須有陰、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品。

2.6 兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，解盲并統(tǒng)計(jì)兩組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Kappa系數(shù)一致性檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 異硫氰酸標(biāo)記沙眼衣原體主要外膜蛋白抗體檢測(cè)試劑的最佳反應(yīng)條件

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定沙眼衣原體檢測(cè)試劑的最佳反應(yīng)條件為：營(yíng)養(yǎng)肉湯作為涂片介質(zhì)、pH值7.0，試劑量8μL，孵育時(shí)間45min，孵育溫度37℃，孵育環(huán)境保持一定濕度，恒溫水浴最佳，PBS+吐溫洗劑可作為沖洗用水。

若無(wú)營(yíng)養(yǎng)肉湯可用生理鹽水涂片。若無(wú)PBS+吐溫洗劑，去離子水與自來(lái)水也可作為沖洗用水。反應(yīng)過(guò)程避光。見表1。

2 異硫氰酸標(biāo)記沙眼衣原體主要外膜蛋白抗體特異性

與淋病奈瑟菌標(biāo)準(zhǔn)株、分離株，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、分離株，與無(wú)乳鏈球菌分離株均無(wú)反應(yīng)。與生殖道常見的球菌無(wú)交叉反應(yīng)。適用于生殖道感染標(biāo)本。見表1、圖1。

表1 沙眼衣原體檢測(cè)試劑最佳反應(yīng)條件

續(xù)表

圖1 FTIC標(biāo)記主要外膜蛋白單克隆抗體檢測(cè)沙眼衣原體及交叉實(shí)驗(yàn)（100×10）

3 異硫氰酸標(biāo)記沙眼衣原體主要外膜蛋白抗體和PCR法檢測(cè)臨床樣本

按照最佳反應(yīng)條件對(duì)臨床試驗(yàn)樣本共142份進(jìn)行了檢測(cè)，異硫氰酸熒光素標(biāo)記沙眼衣原體主要外膜蛋白抗體檢測(cè)出陽(yáng)性10例，陰性132例；PCR法共檢測(cè)出陽(yáng)性11例，陰性131例。與PCR法相比，異硫氰酸熒光素標(biāo)記沙眼衣原體主要外膜蛋白抗體準(zhǔn)確率為99.3%，靈敏度為90.9%，特異性為100%，見下表2。Kappa系數(shù)0.894，Kappa一致性檢驗(yàn)，兩種方法結(jié)果一致。

表2 異硫氰酸標(biāo)記沙眼衣原體主要外膜蛋白抗體與PCR檢測(cè)結(jié)果比較

由此得出硫氰酸標(biāo)記沙眼衣原體主要外膜蛋白抗體檢測(cè)沙眼衣原體與PCR結(jié)果幾乎完全一致。操作過(guò)程簡(jiǎn)便，適于臨床樣本沙眼衣原體的檢測(cè)。

討 論

沙眼衣原體感染的流行病學(xué) 據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)道，2012年，青少年及成年人（15～49歲）新增了1.31億人次感染沙眼衣原體，全球感染沙眼衣原體的發(fā)病率，女性為3.8%，男性為3.3%，在國(guó)內(nèi)的性傳播疾病中，生殖道沙眼衣原體感染的每年平均發(fā)生率為1.95%，其中20～29歲生殖道沙眼衣原體感染的發(fā)生率最高。

北京倪安平等報(bào)道檢測(cè)孕婦、盆腔炎患者和STD男女就診者生殖道沙眼衣原體陽(yáng)性率分別為3.3%，6.7%，20.4%和15.6%［1］。廣東生殖道沙眼衣原體的感染發(fā)生率從2006年的每十萬(wàn)人有0.5人升到了2014年每十萬(wàn)人有51.3人［5］。

大陸地區(qū)各醫(yī)療機(jī)構(gòu)所用沙眼衣原體檢測(cè)試劑大部分為進(jìn)口產(chǎn)品，以英國(guó)立明、梅里埃、雅培等公司的產(chǎn)品為主，國(guó)產(chǎn)品牌的試劑常因質(zhì)量問(wèn)題得不到用戶認(rèn)可。研發(fā)快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)，能給醫(yī)生提供可靠診療依據(jù)的試劑、研發(fā)有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的試劑，對(duì)降低檢驗(yàn)成本有積極意義，并促進(jìn)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

MOMP的抗原性MOMP為沙眼衣原體的主要蛋白成分，MOMP蛋白的分子量為40kDa，由387～397個(gè)氨基酸殘基組成富含半胱氨酸的跨膜蛋白，等電點(diǎn)為5.13～5.15。它的結(jié)構(gòu)包含有16個(gè)跨膜區(qū)域。有較強(qiáng)的抗原性［12］，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體，并且作為抗體的特異性靶抗原［13-14］。衣原體主要外膜蛋白（MOMP）由Opml基因編碼，是沙眼衣原體的表面優(yōu)勢(shì)蛋白，占外膜蛋白60%，在衣原體各型別間具有84%～97%的同源性。

重組主要外膜蛋白MOMP提取天然的MOMP蛋白費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不能滿足試劑生產(chǎn)的需要。HE等［15］報(bào)道，表達(dá)沙眼衣原體的重組主要外膜蛋白（rMOMP），由于MOMP內(nèi)部結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，導(dǎo)致MOMP蛋白很難重組合成且不能準(zhǔn)確的折疊，表達(dá)量也不高。用無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)重組MOMP蛋白作為免疫原，能成功表達(dá)該蛋白，MOMP蛋白免疫小鼠，產(chǎn)生的抗體，經(jīng)過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（western blot）及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等實(shí)驗(yàn)證明，無(wú)細(xì)胞表達(dá)的重組MOMP蛋白產(chǎn)生的抗體能檢測(cè)沙眼衣原體。Pengfei Jiang等通過(guò)生物信息學(xué)的手段，利用MOMP261-276、MOMP70-81及MOMP370-387三段多肽作為免疫原，通過(guò)western blot，ELISA及熒光免疫法（IFA）等實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了MOMP的三段特異性多肽能作為檢測(cè)沙眼衣原體的免疫原。

標(biāo)記MOMP抗體 標(biāo)記異硫氰酸熒光素（FITC）的抗體與沙眼衣原體抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下，能發(fā)出蘋果綠的熒光，通過(guò)蘋果綠的熒光及形態(tài)判斷沙眼衣原體。由于FITC分子量小，用其標(biāo)記抗體不會(huì)影響抗體與抗原的結(jié)合［2］，如上所述，多數(shù)研究者選擇用MOMP蛋白作為免疫原，因?yàn)镸OMP蛋白是15種沙眼衣原體都存在特異性蛋白，通過(guò)免疫兔或小鼠，獲得的血清，利用特異性抗原或protein G親和柱純化血清中的IgG抗體，將IgG抗體標(biāo)記FITC后，標(biāo)記了FITC的抗體與沙眼衣原體抗原特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下可以觀察到。

標(biāo)記檢測(cè)方法比較和應(yīng)用 沙眼衣原體培養(yǎng)和直接免疫熒光分析（DFA）、酶免疫分析（EIA）、核酸雜交測(cè)試和核酸擴(kuò)增檢測(cè)（NAAT）均可用于在宮頸管和男性的尿道拭子沙眼衣原體診斷。沙眼衣原體培養(yǎng)是檢測(cè)方法的金標(biāo)準(zhǔn)。NAAT是美國(guó)食品藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于尿液或陰道拭子最敏感的診斷沙眼衣原體感染的方法［16］。

非特異性染色是免疫熒光法觀察沙眼衣原體時(shí)的干擾。對(duì)于生殖道標(biāo)本中可能存在的形態(tài)為球形的細(xì)菌如金黃色葡萄球菌、淋病奈瑟菌、無(wú)乳鏈球菌做了交叉實(shí)驗(yàn)，排除了觀察過(guò)程的干擾。熒光標(biāo)記MOMP抗體檢測(cè)沙眼衣原體的方法快速、直觀，結(jié)果與基因擴(kuò)增有較好的一致性，適合臨床診斷［17］。