SD乳鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外改良篩選法培養(yǎng)及鑒定

李 楠，翁軍權，謝華德，孫海鵬

［深圳市人民醫(yī)院（暨南大學第二臨床醫(yī)院 南方科技大學第一附屬醫(yī)院）口腔科，廣東 深圳518020］

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種存在于骨髓支持組織中具有多向分化潛能的成體干細胞，在相關的培養(yǎng)基誘導下可以分化為不同的細胞系，例如骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞等［1-2］。BMSCs可在體外大量培養(yǎng)擴增，同時能夠長時間保持未分化狀態(tài)，易于體外基因轉(zhuǎn)入與表達，是組織工程領域理想的種子細胞，在干細胞移植、基因治療、組織工程及再生醫(yī)學等方面的研究中具有重要的意義［3］。在骨缺損區(qū)植骨愈合的過程中，植骨材料傳導成骨或誘導成骨，其生物學基礎是BMSCs被誘導成骨分化為骨細胞，骨細胞的數(shù)量多少取決于BMSCs的數(shù)量。雖然骨髓中存在許多細胞，但是成分非常復雜，在數(shù)量眾多的骨髓單核細胞中，BMSCs的含量并不高，僅占0.001% ～0.01%［4］。因此，建立一種簡單高效的BMSCs體外分離培養(yǎng)、純化與擴增的方法具有十分重要的臨床價值。大鼠為研究中最常用的BMSCs提取動物之一，目前常用成年大鼠骨髓的貼壁篩選法分離培養(yǎng)BMSCs。但是，有關人體研究顯示，年齡影響B(tài)MSCs的增殖能力［5］，兒童的BMSCs增殖速度是成人的2倍以上［6］。ZHANG等［7］發(fā)現(xiàn)幼年大鼠BMSCs數(shù)量多于成年大鼠，因此推斷供體年齡可能與BMSCs擴增能力及獲取數(shù)量密切相關。ASUMDA等［8］比較4月齡及15月齡大鼠，發(fā)現(xiàn)15月齡大鼠BMSCs 24 h貼壁數(shù)量較少，增殖速度慢，且呈平攤放大的形態(tài)。VALYUSHINA等［9］分別從1月齡及12月齡大鼠體內(nèi)分離BMSCs并進行培養(yǎng)，1月齡大鼠（發(fā)育早期）細胞增殖能力明顯增強，12月齡大鼠（成年）體內(nèi)分離出的細胞量少、增殖慢、前體細胞集落增殖能力降低。乳鼠骨髓可能含有更多的鼠類骨髓間充質(zhì)干細胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs），其增殖能力及多向分化能力可能更好。因此，本研究選用出生7 d齡SD乳鼠，采用改良的貼壁篩選法分離培養(yǎng)BMSCs，探究此模型及方法對BMSCs分離培養(yǎng)擴增的效果，評估BMSCs成骨及成脂分化功能，并且對其細胞表面標志物進行鑒定，為口腔牙槽骨骨再生的研究奠定種子細胞基礎。

材料和方法

1 實驗動物及試劑

成年斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬祝⊿prague-Dawley，SD）乳鼠6只，雄性，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，體重5～7g，飼養(yǎng)于中山大學北校區(qū)動物中心SPF級大鼠飼養(yǎng)室，適應性喂養(yǎng)7 d，自由進食及飲水。小鼠抗大鼠CD34-PE、CD45-PE、CD90-FITC、CD44-FITC、CD29-FITC（R&D，USA）；OriCellTM 間質(zhì)干細胞成骨分化誘導培養(yǎng)基、OriCellTM 間質(zhì)干細胞成脂分化誘導培養(yǎng)基（Cyagen，蘇州，中國）。

2 方法

2.1 乳鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)和純化 取6只出生7 d的SD乳鼠（圖1），脫頸處死。浸泡于75%酒精溶液15 min；無菌分離出乳鼠的雙側股骨，并放置于完全培養(yǎng)基中浸泡，剪碎股骨，盡量使股骨骨髓腔外露，骨髓內(nèi)細胞溢出；將剪碎的股骨以及骨髓細胞懸液高速震蕩5 min，可見剪碎的股骨逐漸由紅色變?yōu)榘咨▓D2）；取紅色的上清液，分別接種到2個25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2的孵箱中進行原代培養(yǎng)；原代培養(yǎng)24 h后半量換液，可見大量的懸浮的血細胞，48 h后全量換液，去除大部分懸浮的血細胞。之后每兩天更換一次培養(yǎng)基，待培養(yǎng)瓶底壁細胞融合至85%～90%時按照一傳三的比例進行傳代培養(yǎng)。

圖1 7d齡SD乳鼠

圖2 7d齡SD乳鼠的股骨

2.2 繪制BMSCs的生長曲線 取第3代乳鼠BMSCs，消化離心后制備成l×104/mL密度單細胞懸液；接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL單細胞懸液，總共接種8個96孔培養(yǎng)板；每天選取1個96孔培養(yǎng)板，每孔加入（完全培養(yǎng)基：CCK-8＝10：1）混合液體200μL，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育培養(yǎng)2 h；應用酶標儀檢測各孔OD值，記錄計算均值。連續(xù)測量8d，制作細胞生長曲線。

2.3 評估乳鼠BMSCs成骨和成脂分化能力

培養(yǎng)第3代BMSCs細胞至50%～70%的融合，棄去完全培養(yǎng)液，每孔加入2mL的成骨分化誘導液進行誘導；每隔2 d換新的成骨分化完全培養(yǎng)基；分化誘導3周，PBS洗滌2次后加入2mL 4%多聚甲醛固定30 min，吸去4%多聚甲醛，PBS洗滌2次后每孔1 mL的茜素紅染色3 min；去除染液，PBS洗2次，倒置顯微鏡下拍照。

培養(yǎng)第3代BMSCs細胞至50% ～70%的融合，棄去完全培養(yǎng)液，每孔加入成脂分化誘導A液2mL進行成脂誘導；3 d后，小心吸除成脂分化誘導A液，每孔加入成脂分化誘導B液2mL繼續(xù)進行成脂誘導；1 d后，再更換為成脂分化誘導完全培養(yǎng)基A進行成脂誘導；如此更換3次后，最后用成脂分化誘導完全培養(yǎng)基B繼續(xù)維持1周。吸去成脂分化誘導培養(yǎng)基，PBS洗滌，加入2mL的4%多聚甲醛固定30min后，吸去4%多聚甲醛，PBS洗滌2次，每孔加入油紅“O”工作液（油紅：雙蒸水＝3：2，用定性濾紙過濾）1mL染色30min；去除染液，PBS洗滌兩次，倒置顯微鏡下拍照。

2.4 流式細胞儀檢測BMSCs表面標志物 取第3代的乳鼠BMSCs，制備成密度為2×106單細胞懸液，取7管單細胞懸液，每管100μL，分別加入A：5μL IgG1-PE；B：5μL IgG1-FITC；C：5μL CD34-PE單克隆抗體；D：5μL CD45-PE單克隆抗體；E：5μL CD90-FITC單克隆抗體；F：5μL CD44-FITC單克隆抗體；G：5μL CD29-FITC 單克隆抗體；各管孵育30min后，用PBS洗2次，加入緩沖液重懸，流式細胞儀檢測。

結 果

1 BMSCs細胞形態(tài)學觀察

原代培養(yǎng)：將乳鼠骨髓細胞懸液剛剛接種到培養(yǎng)瓶時，細胞懸液外觀為紅色，鏡下觀察到大量懸浮的圓形細胞；原代培養(yǎng)24 h首次半量更換培養(yǎng)液時，透過懸浮的圓形細胞，可見培養(yǎng)瓶壁上散在的貼壁細胞，針狀，晶亮；原代培養(yǎng)48 h全量更換培養(yǎng)液時，可見培養(yǎng)瓶壁上更多的貼壁細胞，梭狀，透亮；經(jīng)過24 h半量換液及48 h全量換液后，培養(yǎng)瓶內(nèi)懸浮的圓形細胞基本被清除；原代培養(yǎng)72 h觀察到培養(yǎng)瓶內(nèi)貼壁細胞呈長梭狀，增殖迅速，開始融合；原代培養(yǎng)120 h觀察到培養(yǎng)瓶內(nèi)貼壁細胞增殖迅速，融合區(qū)域大約占培養(yǎng)瓶壁的85%～90%，長梭狀或紡錘狀。

原代培養(yǎng)第5天第一次傳代，第二代細胞保持長梭狀，貼壁時間短（12h內(nèi)完成），增殖旺盛，大約3～4 d后就可以再次傳代（圖3）。

圖3 接種48 h后貼壁細胞

2 BMSCs生長曲線

乳鼠BMSCs的生長曲線大體呈一個拉伸的“S”形。最初，接種第1～2天，為細胞生長潛伏期；接著，第3～6天細胞進入對數(shù)快速增殖期；然后，第6天細胞增殖達到高峰；最后，第7天細胞進入平臺期，生長變慢（圖4）。

圖4 乳鼠BMSCs生長曲線

3 BMSCs成骨及成脂分化能力

BMSCs經(jīng)成骨誘導后呈復層生長，胞體由長梭狀變?yōu)槎噙呅螤?，體積變大，隨著時間的推移，鏡下可見胞漿內(nèi)逐漸出現(xiàn)黑色小顆粒，黑色小顆粒越來越多形成大小不等的結節(jié)，結節(jié)增多增大逐漸形成團塊。經(jīng)成骨誘導3周后茜素紅染色在細胞外基質(zhì)中可見深紅色團塊，提示形成鈣化結節(jié)，具有較強的成骨能力（圖5）。

圖5 乳鼠BMSCs成骨誘導21天后茜素紅染色，可見深紅色團塊狀鈣化結節(jié)

BMSCs經(jīng)成脂誘導后呈復層生長，胞體由長梭狀變?yōu)閳A形，體積逐漸變大，隨著時間的推移，鏡下起初可見胞漿內(nèi)出現(xiàn)較小折光性很強的脂滴，隨后小脂滴聚集形成較大的脂滴，最后脂滴形成串珠狀。經(jīng)成脂誘導四周后油紅“O”染色可見細胞內(nèi)大小不等的串珠狀橘紅色脂滴，提示脂肪細胞的形成，具有較強的成脂能力（圖6）。

圖6 乳鼠BMSCs成脂誘導28天油紅染色，可見串珠狀紅色脂滴

4 鑒定BMSCs表面標志物

第3代培養(yǎng)細胞表面抗原CD分子流式細胞儀檢測結果（圖7）：CD29約97.06%，強陽性表達；CD44約96.76%，強陽性表達；CD90約96.96%，強陽性表達；CD34約0.53%，陰性表達；CD45約0.96%，陰性表達。

圖7 流式細胞儀鑒定分離培養(yǎng)BMSCs表面標志物

討 論

目前，大鼠BMSCs體外分離培養(yǎng)方法較多，但無統(tǒng)一標準。最常用方法主要有4種：全骨髓貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法、免疫磁珠分選法以及流式細胞儀分選法［10］。

上世紀70年代FRIEDENSTEIN最先提出全骨髓貼壁培養(yǎng)法，運用該方法時，骨髓細胞中的造血細胞在原代培養(yǎng)接種后會懸浮生長，而BMSCs會貼壁生長，通過換液及傳代使細胞分離與純化，至今仍為應用廣泛的經(jīng)典方法［11］。該方法操作簡便，細胞損傷較小同時細胞活性較高。與其他方法相比，全骨髓貼壁法早期保留了多種細胞，模擬體內(nèi)生長環(huán)境，含有各種生長因子、促黏附物質(zhì)等，細胞生長增殖迅速［12］。該方法缺點是獲得的BMSCs純度略顯不足，可能含有骨髓中其他種類細胞。但也有學者實驗研究證實傳代與換液后該方法與密度梯度離心法獲得細胞純度無明顯區(qū)別，特別是在3、4代后［12-13］。

BMSCs與其他細胞密度的不同，位于1.05～1.08個/m3密度區(qū)間，密度梯度離心法就依據(jù)這一特性，采用密度相對應的分離液將BMSCs與其他細胞分離開來［11］。密度梯度離心法優(yōu)點是所獲得的細胞純度高，對細胞活性影響較小。HOU等［14］利用密度梯度離心法獲得了純度滿意的BMSCs。但是與全骨髓貼壁培養(yǎng)法相比，該方法原代培養(yǎng)時間長，原因可能是培養(yǎng)早期BMSCs密度相對較低，分泌的生長因子不足；離心后純化的BMSCs失去了造血系細胞的旁分泌作用；離心導致細胞流失。另外，此法分離的細胞容易出現(xiàn)“老化”，原因可能與離心導致的某些生長因子喪失及高速離心對細胞本身的機械損傷有關［15］。密度梯度離心法操作開放，污染機會較大，而且細胞分離液有無毒性，對細胞有無影響目前尚無定論，此法分離后得到的細胞需洗滌后才可進行移植治療。

免疫磁珠分選法及流式細胞儀分選法是利用細胞表面特異性抗原與抗體結合進行分離。這兩種方法處理細胞量大、種類廣、所分離的細胞純度最高［16］。但是BMSCs較脆弱，分選時易產(chǎn)生機械損傷，細胞活性受影響，甚至完全丟失。此外，這兩種方法要求有一定量的骨髓組織以及特殊的儀器，費用昂貴，操作繁瑣，BMSCs單克隆抗體的缺乏也限制上述分選技術的運用。

傳統(tǒng)的BMSCs取材方法為取得大鼠股骨與脛骨后剪去干骺端膨大的部分，利用細針頭將骨髓抽出［17］。謝茂松等［18］認為，股骨和脛骨的干骺端含有大量骨髓，其運用改良貼壁篩選法，保留干骺端骨

髓，從中間剪斷股骨干和脛骨干，能夠獲取更多的

BMSCs。

細胞種植密度影響細胞的生長，密度過高引起貼壁細胞之間無足夠的伸展空間，導致接觸抑制；密度過低則導致分泌的細胞因子不足，影響生長及增殖，且細胞達到傳代所需密度的時間延長，導致原代細胞容易“老化”，損害傳代后細胞的擴增能力和分化潛能。MEIRELLES等［19］在1×109/L接種密度獲得的細胞最早出現(xiàn)貼壁、伸展。有學者實驗研究在1×106/L密度接種獲取細胞數(shù)量最多［20］。有研究認為極低密度小于8×103/L傳代更有利于細胞增殖與保持細胞多向分化潛能［21］。但是，全骨髓貼壁法所得細胞成分復雜，難以進行準確的BMSCs細胞計數(shù)，因此不同研究者采用的傳代BMSCs密度有所不同，至今尚未有統(tǒng)一標準。

由于骨髓中BMSCs豐度不高，所以必須使獲得的BMSCs盡可能多貼壁，有報道首次換液時間對BMSCs生長增殖有一定影響［12］。換液時間過早則許多BMSCs尚未貼壁，骨髓其他細胞分泌的促干細胞生長因子隨換液而遺失；換液時間過晚一方面懸浮的造血細胞占據(jù)培養(yǎng)瓶壁空間，干擾BMSCs的貼壁，另一方面其他細胞可爭奪營養(yǎng)物質(zhì)，難以通過換液及時除去這些雜質(zhì)細胞，抑制BMSCs的增殖，影響B(tài)MSCs純度。莊淑波等［22］發(fā)現(xiàn)第5天后不再有新的細胞貼壁。有學者分別在接種后6、12、24、48、72 h進行首次換液，結果48 h組細胞數(shù)量明顯高于其余各組［20］。而ZHAO等［23］在24 h首次換液獲得了滿意的效果。LI［12］采用培養(yǎng)24 h首次半量換液的方法，既部分清除了大量懸浮的造血系細胞，又保證了造血系細胞旁分泌的細胞因子對BMSCs的滋養(yǎng)作用。

本研究采用出生7 d齡的SD乳鼠，利用改良的全骨髓自然貼壁篩選法分離培養(yǎng)BMSCs。改良的全骨髓自然貼壁篩選法具體包括：①保留乳鼠股骨干骺端膨大的部分，將股骨剪碎，保留干骺端內(nèi)豐度較高的BMSCs；②采用原代培養(yǎng)24 h首次半量換液及48 h后全量換液的方法，既清除大量懸浮的造血系細胞，同時保留造血系細胞通過旁分泌機制分泌的具有滋養(yǎng)BMSCs的細胞因子，獲得較多數(shù)量的BMSCs，純度較高；③在細胞傳代時按照1×106/L密度接種，細胞生長及增殖較快。

迄今，尚未發(fā)現(xiàn)鑒定MSCs的單獨特異性表面標志物，但是鑒定人類MSCs至少有3個方面的標準：①細胞貼附塑料瓶壁生長；②細胞表面表達CD73、CD90和CD105，不表達CD31、CD34和CD45；③細胞能夠分化成脂肪細胞、軟骨細胞和骨細胞［24-25］。除去細胞表面不表達CD73和CD90或者表達異質(zhì)的CD73和CD90，大鼠MSCs與人類MSCs基本類似［26-27］。由于細胞組織來源、分離培養(yǎng)方法的差異，因而檢測到的MSCs細胞標志物亦不盡相同。

在本研究中，從7d齡乳鼠骨髓原代分離培養(yǎng)的細胞可以在塑料培養(yǎng)瓶中貼壁生長；體外誘導成功分化為骨細胞和脂肪細胞，具有多向分化潛能；流式細胞術鑒定其細胞表面強陽性表達CD29、CD44、CD90，陰性表達CD34和CD45；符合間充質(zhì)干細胞的特性和標準。本研究采用7 d齡SD乳鼠全骨髓自然貼壁篩選法并進行相應改良，取得較好的效果，為口腔牙槽骨骨再生的研究奠定種子細胞基礎。