數(shù)字病理掃描在頸動脈粥樣硬化斑塊組織學(xué)研究中的應(yīng)用

曹敬麗，孫 杰，Marina S.Ferguson，張 東，沈 宓，隋濱濱，劉 麗，李子瑞，趙錫海，Thomas S.Hatsukami，苑 純，，，高培毅，4，王雅杰，6

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 國家神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京100070；2.美國華盛頓大學(xué)血管成像實驗室，美國 西雅圖90876；3.清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)影像研究中心，北京100084；4.北京市神經(jīng)外科研究所，北京100070；5.腦血管病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室，北京100070；6.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院，北京100011）

頸動脈粥樣硬化斑塊的形成是腦血管病變的獨立危險因素之一［1-2］。動脈粥樣硬化斑塊主要分為兩類：穩(wěn)定斑塊和易損斑塊。穩(wěn)定斑塊一般具備纖維帽厚、脂質(zhì)核小、炎癥反應(yīng)輕等特點，不易形成缺血事件。易損斑塊破裂危險高，形成血栓栓塞的危險性也高，并可導(dǎo)致管腔狹窄、閉塞、斑塊內(nèi)出血等，容易發(fā)生缺血事件［3-4］。對頸動脈粥樣硬化斑塊進行充分的組織學(xué)判讀和研究，將有助于通過全面把握斑塊的組織學(xué)表現(xiàn)進而推進臨床輔助診斷的改進［5］。隨著數(shù)字化病理的發(fā)展，數(shù)字病理掃描儀在組織切片的掃描質(zhì)量和分析功能上也在迅速的提升［6］。數(shù)字病理掃描應(yīng)用于頸動脈粥樣硬化斑塊組織學(xué)切片，將有助于科研工作者對頸動脈粥樣硬化斑塊的組織學(xué)表現(xiàn)快速全面地掌握，進而對組織學(xué)進行充分地判讀和分析。本文中，我們將介紹一下數(shù)字病理掃描在頸動脈粥樣硬化斑塊組織學(xué)研究中的應(yīng)用，便于有相同科研需求的同行引用和參考。

材料和方法

1 標(biāo)本來源

頸動脈粥樣硬化斑塊橫斷面切片所需的頸動脈粥樣硬化斑塊取自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院CEA手術(shù)，樣本取材獲得了倫理委員會的批準(zhǔn)和病人的知情同意。

2 實驗試劑和耗材

蘇木素，伊紅，中性樹膠封片劑，蓋玻片，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、二甲苯、1%鹽酸酒精分化液和1%氨水反藍液，均購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司。

3 主要儀器

數(shù)字病理掃描儀，Leica Aperio CS2（德國徠卡）。

4 方法

4.1 H&E染色 取頸動脈粥樣硬化斑塊的切片，于60℃烘烤30min，趁熱浸入二甲苯15min×2，充分脫蠟。然后，經(jīng)梯度酒精濃度從高到底，即100%酒精10min×2，95%酒精8min×2，85%酒精5min，75%酒精5min，完成水化。水化后將組織切片浸沒在蘇木精中染色10min，以蒸餾水速洗，用1%鹽酸酒精分化6-8s，以蒸餾水速洗，用1%氨水反藍1-2min，以蒸餾水漂洗2遍，伊紅染色5min，蒸餾水速洗，完成染色，上述步驟均常溫進行。染色結(jié)束后，經(jīng)梯度酒精濃度從低到高脫水并二甲苯透明后用中性樹膠封片，晾干，室溫保存。

4.2 數(shù)字病理掃描 待封片后的切片晾干后，可進行數(shù)字病理掃描。掃描前，按正確的順序開機掃描儀和電腦，并啟動掃描專用的軟件，啟動過程中等待系統(tǒng)成功完成啟動和自檢，使電腦可通過軟件操作調(diào)整掃描設(shè)置。掃描時，將待掃描的切片正確置于數(shù)字病理掃描儀的切片架上，系統(tǒng)會對待掃描的組織切片進行預(yù)覽并識別出待掃描的區(qū)域。通過預(yù)覽圖像可觀察到自動識別的準(zhǔn)確性，對于識別區(qū)域與組織切片所在的位置有偏差的樣本，可依據(jù)組織的位置和輪廓來校準(zhǔn)掃描的區(qū)域，儀器可對校準(zhǔn)后的掃描區(qū)域自動對焦進行掃描。鑒于組織切片在不同位置聚焦點略有差異，在待掃描的區(qū)域適當(dāng)增加聚焦點將有助于掃描出全景均清晰的圖像。通過對組織切片實行數(shù)字化掃描，獲得組織全層面圖像，將圖像妥善保存在硬盤上，供后續(xù)閱讀和分析使用。

結(jié) 果

1 數(shù)字病理掃描所得的圖片有助于全面地掌握和保存頸動脈粥樣硬化斑塊組織切片的全層面信息

通過數(shù)字病理掃描獲得的圖片，在圖片的任何部位均可放大瀏覽和查看。如圖1A所示，數(shù)字病理掃描后可獲得斑塊組織切片全層面的高質(zhì)量圖片，在該圖片上，可以用鼠標(biāo)作為輔助工具移動和瀏覽圖片，可以對圖片任意位置放大和縮小以便于瀏覽細(xì)節(jié)和全貌，其放大的倍數(shù)取決于掃描時所選擇的物鏡倍數(shù)，在本掃描系統(tǒng)中，最大可達到40×光學(xué)放大。鑒于動脈粥樣硬化斑塊組織成分組成的復(fù)雜性，本項掃描有助于科研工作者迅速掌握斑塊切片全層面的組織學(xué)表現(xiàn)，亦有助于數(shù)字化之后的組織學(xué)信息永久性地保存。如圖1 B&C所示，可對組織切片的任意部位進行適當(dāng)?shù)姆糯箫@示，以便于輔助閱讀組織成分的細(xì)微之處。本文以圖1 B&C為例展示局部20×光學(xué)放大后的顯示效果。圖1 B為斑塊內(nèi)血栓，從圖像可看出，血栓大部分已出現(xiàn)機化，并且，與血栓相鄰的區(qū)域，存在著較豐富的大小不等的泡沫細(xì)胞，隨著病情的進展，此處發(fā)展為脂質(zhì)壞死核的可能性大。相比于MRI和超聲影像，組織學(xué)判讀能看到更豐富的細(xì)節(jié)表現(xiàn)，進而更精確地輔助判斷斑塊所處的分期。圖1 C為斑塊內(nèi)局灶性出血表現(xiàn)，從圖像可以看出較豐富的新鮮紅細(xì)胞滲透入斑塊基質(zhì)內(nèi)，在科學(xué)研究中，結(jié)合斑塊連續(xù)切片中相鄰層面的表現(xiàn)，將有助于綜合判斷該出血灶在斑塊中的體積以及對斑塊穩(wěn)定性的影響。

圖1 數(shù)字病理掃描所得的圖片有助于全面地掌握和保存頸動脈粥樣硬化斑塊組織切片的全面信息

2 數(shù)字病理掃描獲得的圖片在軟件的幫助下有助于非常方便地測量斑塊內(nèi)各成分的大小

數(shù)字病理成像時，系統(tǒng)會為圖片自動生成比例尺，比例尺可依據(jù)圖像放大倍數(shù)的不同而自動調(diào)整。系統(tǒng)也會自帶測量工具，方便測量。如圖2所示，①為與圖1C相同的區(qū)域，為一小的滲血灶，我們可以借助于軟件中自帶的測量工具對該滲血灶的任意直徑作出精確的測量，可精確到μm，如圖2①所示，本層面滲血灶最寬處的橫徑為473.1μm。圖2②所示為纖維帽的厚度，借助于測量工具，我們可以任意測量纖維帽最厚的地方和最薄的地方相關(guān)的厚度值，進而在研究工作中輔助判斷斑塊的穩(wěn)定性，本次測量的纖維帽厚度是791.0μm。結(jié)合JESSICA等的研究結(jié)果［7］，頸動脈粥樣硬化斑塊纖維帽厚度小于200μm時不穩(wěn)定。從圖像中測量處的右側(cè)可以看出，本層切片中的纖維帽有更薄的地方。本次測量僅用于示例軟件在纖維帽厚度測量中的方法，若涉及評估斑塊纖維帽的穩(wěn)定性，則需要挑出纖維帽最薄的位置做出測量。圖2③所示為纖維帽所覆蓋的不穩(wěn)定成分，本層圖片顯示纖維帽所覆蓋的成分組成比較復(fù)雜，即含有機化的血栓，也含有進展中的脂質(zhì)壞死成分，其過大的體積參與了斑塊不穩(wěn)定性，本次測量的其最大的厚度直徑是2.263mm。圖2④所示為陳舊的斑塊內(nèi)出血，最厚的地方是1.324mm。圖2⑤所示淺染區(qū)域為脂質(zhì)池，在動脈粥樣硬化斑塊中，脂質(zhì)池比較穩(wěn)定，本圖所示測量其厚度為528.9μm。在MRI中，脂質(zhì)池與脂質(zhì)壞死核呈現(xiàn)相同的信號，在組織學(xué)判讀中，我們可以清晰地看出脂質(zhì)池與脂質(zhì)壞死核的組成成分并不同，相比之下，充分的組織學(xué)研究更有助于對斑塊組成成分的精準(zhǔn)判讀和分析。

圖2 數(shù)字病理掃描獲得的圖片在軟件的幫助下有助于非常方便地測量斑塊內(nèi)各成分的大小

圖3 數(shù)字病理成像有助于精確評估斑塊的狹窄程度

3 數(shù)字病理成像有助于精確評估斑塊的狹窄程度

如圖3所示，本層切片中，斑塊最厚處的管腔直徑為2.655mm，全徑（斑塊+管腔）為7.854mm，在本層圖片計算斑塊的狹窄率為（1-2.655/7.854）×100%＝66%，如此，測量評估獲得本層面切片斑塊的狹窄率為66%。若精準(zhǔn)的評估本斑塊整體的狹窄率，需結(jié)合頸動脈粥樣硬化斑塊冠狀切面連續(xù)切片后不同層面的信息綜合分析獲得。本文通過圖中層面展示數(shù)字病理成像系統(tǒng)測量和評估的方法。

討 論

隨著人工智能的發(fā)展［8-10］，人工智能將逐漸應(yīng)用于MRI等影像學(xué)輔助診斷［11-13］。對于頸動脈粥樣硬化斑塊，人工智能將有助于高效率地判斷斑塊成分，并較準(zhǔn)確地輔助預(yù)測斑塊穩(wěn)定性。通過頸動脈粥樣硬化斑塊連續(xù)切片所獲得的數(shù)字病理圖像，結(jié)合MRI信息，有助于對組織學(xué)與MRI進行相同層面的比對，比對后將有助于對斑塊成分的精準(zhǔn)判斷與精確評估。在人工智能的訓(xùn)練方面，結(jié)合數(shù)字病理掃描所獲得的頸動脈粥樣硬化斑塊各層面的組織學(xué)信息，將有助于提高MRI影像學(xué)人工智能輔助診斷的精準(zhǔn)性和敏感性。

2014年初至2018年底，我們在項目開展過程中，為了對頸動脈粥樣硬化斑塊進行有效的分析，需要獲得高質(zhì)量的數(shù)字病理掃描圖像和分析軟件。由此，我們在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院先后分別聯(lián)系并試用了多家數(shù)字病理掃描儀樣機，比如：Zeiss、Leica、羅氏等，本文所展示的圖片系Leica Aperio CS2掃描所獲得。經(jīng)試用后發(fā)現(xiàn)，不同廠家的數(shù)字病理掃描儀均能順利地完成斑塊切片全層面的數(shù)字病理掃描，也或多或少地匹配了一部分測量和分析功能。但是，在頸動脈粥樣硬化斑塊的輔助分析方面，目前均缺乏配套的、完善的分析軟件。主要難點在于：（1）無法將頸動脈粥樣硬化斑塊連續(xù)切片的不同層面像MRI那樣進行3D整合；（2）對于頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的復(fù)雜成分，無法便利地劃分和測量，比如測量脂質(zhì)核、斑塊內(nèi)出血灶、鈣化等的周長、面積、占比等。如果數(shù)字病理掃描儀配套的分析軟件能夠及時地跟上儀器硬件的發(fā)展，將有助于頸動脈粥樣硬化斑塊組織學(xué)分析工作的推進。