巖白菜中熊果苷積累動態(tài)分析

林 凱, 王仕玉, 郭鳳根*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,云南 昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院,云南 昆明650201)

巖白菜Bergenia purpurascens(Hook.f.et Thoms.) Engl.是虎耳草科巖白菜屬多年生草本植物,通常生長在海拔2 500 ～4 800 m 的林下、灌叢、高山草甸和高山碎石隙中,主要分布在四川、云南、西藏等地［1］,一般以干燥根莖入藥,具有收斂止瀉、止血止咳、舒筋活絡(luò)的功效［2］,是西南地區(qū)特色中藥。熊果苷是巖白菜主要次生代謝產(chǎn)物之一,可抑制黑色素細(xì)胞的酪氨酸酶活性,有效阻斷黑色素合成,從而具有顯著的美白效果,是目前十分流行的美白化妝品添加劑［3］,還可用于治療尿道感染［4］、預(yù)防腦細(xì)胞損傷［5］、改善葡萄酒品質(zhì)［6］等,具有較大的開發(fā)和應(yīng)用價值,但它在植物中的含有量普遍較低,巖白菜是少數(shù)幾種富含該成分的植物之一。本研究對巖白菜中熊果苷含有量進(jìn)行測定,通過分析其動態(tài)變化,篩選出最佳采收時期、利用部位,以期為充分開發(fā)利用該資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent 1260 型高效液相色譜儀,配置紫外檢測器(美國安捷倫公司)；CP214 型電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；DHG-9203A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(寧波江南儀器廠)；SB-4200DTD 型超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技有限公司)；DFY-200 型粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)。熊果苷對照品(批號GZDD-0066,含有量＞98.9%,貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司)。甲醇為色譜純；磷酸等試劑均為分析純；水為自制超純水。

1.2 供試樣品 巖白菜種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)農(nóng)場,經(jīng)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)郭鳳根教授鑒定為正品,于2 月至11 月間采樣,分為8 個采收時期,以及根、一年生根狀莖、二年生根狀莖、三年生根狀莖、葉柄、幼葉、成熟葉、老葉8 個部位。藥材烘干后分別粉碎,過200 目篩后備用。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液制備 精密稱取熊果苷對照品0.001 5 g,加甲醇定容至10 mL,搖勻,即得(0.15 mg/mL)。

1.3.2 供試品溶液制備 精密稱取已處理好的樣品粉末0.100 g,置25 mL 量瓶中,加入60%甲醇定容至25 mL,稱定質(zhì)量,超聲提取40 min(功率250 W、頻率50 kHz),冷卻至室溫,稱定質(zhì)量,甲醇補足減失的質(zhì)量,振蕩搖勻后1 500 r/min 離心10 min,取上清液過0.45 μm 微孔濾膜,取1 mL 左右濾液,即得。每份樣品重復(fù)3 次。

1.3.3 色譜條件［7］Agilent Hypersil ODS 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相甲醇(B) -0.1%磷酸(A),梯度洗脫(0 ～10 min,5%～10%B；10 ～18 min,10%～18%B；18.10～23 min,100%B；23.10 ～28 min,5%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長274 nm；進(jìn)樣量5 μL。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 Excel 軟件整理原始數(shù)據(jù)并作圖,SPSS 19.0 軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察 取對照品溶液(0.15 mg/mL) 1、2、2.5、3、3.5、4、5 μL,在“1.3.3” 項色譜條件下進(jìn)樣。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,得方程Y ＝428.51X-2.671 4 (r ＝0.999 2),在0.01 ～1.4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 熊果苷HPLC 色譜圖

2.2 不同部位中熊果苷含有量 含有量測定結(jié)果見圖2,發(fā)現(xiàn)存在極顯著差異,依次為成熟葉＞老葉＞幼葉＞葉柄＞一年生根狀莖＞三年生根狀莖＞二年生根狀莖＞根,即根中最低,極顯著低于葉柄及葉片中(P＜0.01),顯著低于一年生根狀莖中(P＜0.05),與二年生、三年生根狀莖中差異不顯著(P＞0.05)；3 種根狀莖中極顯著低于葉柄及葉片中(P＜0.01)；葉柄中極顯著低于葉片中(P＜0.01)；幼葉中顯著低于成熟葉及老葉中(P＜0.05),在成熟葉和老葉中差異不顯著(P＞0.05)。

圖2 不同部位中熊果苷含有量

2.3 不同采收期熊果苷含有量 含有量測定結(jié)果見表1。3 種根狀莖部位中熊果苷含有量為0.206 2%～0.525 1%,而3種葉片中比其高出10 倍左右(2.121 0%～5.678 3%)；同一部位中含有量在不同生長季節(jié)差異甚大,尤其在三年生根狀莖、幼葉、成熟葉和老葉中達(dá)到了極顯著差異。但總體而言,根莖中熊果苷含有量在4、5、11 月份稍高于其他月份,而葉片中11 月份顯著高于其他月份；在11 月份采收的成熟葉中最高,達(dá)5.678 3%。

3 討論與結(jié)論

本研究測定了巖白菜中熊果苷含有量,8 個部位中依次為成熟葉＞老葉＞幼葉＞葉柄＞一年生根狀莖＞三年生根狀莖＞二年生根狀莖＞根,這與姜洪君等［8］報道基本一致。對比已有的相關(guān)報道,巖白菜葉中熊果苷含有量(2.121 0%～5.678 3%) 高 于 梨 花 (0.257 5%)［9］、 草 莓 樹 葉(0.295% ～ 0.306%)［10］、 卷 柏 全 草 (0.164% ～0.327%)［11］、水翁花花蕾(0.055%～0.154 5%)［12］、楊梅葉(1.21%)［13］、睫毛巖白菜葉(1.357%)［14］、杜香全草(0.156%)［14］、馬兜鈴全草(1.724%)［14］中；墨角蘭花及葉(5.13%)［15］、熊果葉(7%～9%)［16］等少數(shù)幾種植物中接近或高于巖白菜,但墨角蘭和熊果主要分布在歐洲、北美洲等地,我國不產(chǎn)這2 種植物,因此,巖白菜葉在國內(nèi)可作為提取熊果苷的優(yōu)質(zhì)資源,具有很好的開發(fā)利用潛力。雖然《中國藥典》 中檢測指標(biāo)為巖白菜素,但它大多積累于根莖,而熊果苷積累于葉,故本實驗重點研究后者時可充分開發(fā)利用該資源。此外,11 月份熊果苷含有量顯著高于其他月份,這與楊虹等［17］對鼓槌石斛中酚類物質(zhì)積累的研究結(jié)果基本一致,而且?guī)r白菜喜陰耐寒,至秋季其葉片面積較大,生物積累量也達(dá)到較高水平。綜上所述,巖白菜最佳利用部位為成熟葉,最佳采收時期為秋季,此時熊果苷含有量最高。

表1 不同采收時期熊果苷含有量（%）