鴨源莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定

王紅琳 盧琴 張騰飛 張文婷 羅青平 汪宏才 張蓉蓉 羅玲 邵華斌

摘要：為了查明監(jiān)利縣某鴨場(chǎng)產(chǎn)蛋鴨突然死亡的病因，對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)菌分離、生化鑒定、PCR擴(kuò)增鑒定、致病性試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，分離菌與多殺性巴氏桿菌同源性達(dá)99.88%，分離菌的莢膜抗原血清型特異性基因PCR產(chǎn)物與莢膜血清A型基因同源性達(dá)99.90%，確定病原菌為莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌;該菌株對(duì)大觀霉素高度敏感，對(duì)阿米卡星、新霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、克林霉素、阿奇霉素等中度敏感，對(duì)頭孢曲松、鏈霉素、復(fù)方新諾明、磺胺異惡唑、氟苯尼考、四環(huán)素、呋喃妥因、潔霉素等具有耐藥性。

關(guān)鍵詞：多殺性巴氏桿菌;莢膜血清A型;PCR鑒定;藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S834+.8? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）12-0116-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.12.027? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： In order to elucidate the cause of sudden death of laying-duck in a duck farm in Jianli， which the pathogen was determined to be capsular serotype A Pasteurella multocida by bacterial isolation，biochemical identification，mouse pathogenicity test and PCR amplification. The results showed that the isolate had 99.88% homology with Pasteurella multocida， and the PCR product of the capsular antigen serotype-specific gene of the isolate was 99.90% homologous with the Capsular Serotype A， and the pathogen was determined to be Pasteurella multocida strains belonged to capsular serotype A. In order to investigate the drug resistance， the results of drug susceptibility test showed the pathogen was highly sensitive to spectinomycin， moderately sensitive to amikacin， neomycin， norfloxacin， ofloxacin， clindamycin， azithromycin， while resistance to ceftriaxone， streptomycin， co-trimoxazole， sulfisoxazole， fluoride benignic， tetracycline， nitrofurantoin， lincomycin， which provided guidance for clinical rational medication.

Key words： Pasteurella mutocida; capsular serotype A; PCR identification; drug-sensitivity test

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella mutocida）可引起鴨巴氏桿菌?。ㄓ址Q鴨霍亂），該病是一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病，產(chǎn)蛋鴨的發(fā)病率較高。常呈現(xiàn)急性敗血癥過(guò)程，急性型發(fā)病率和死亡率可高達(dá)80%～90%，也見(jiàn)慢性或良性經(jīng)過(guò)。呈世界性分布，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要細(xì)菌性傳染病之一;在同種禽間傳染快，在異種禽間可傳染，豬及人類也可攜帶病菌。帶菌的表面健康禽只，在飼養(yǎng)管理不當(dāng)（如斷料、斷水或突然改變飼料），季節(jié)交替、氣候突變等應(yīng)激條件下，動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降時(shí)，易發(fā)生內(nèi)源性傳染而發(fā)病，呈地方性流行[1]。由于多殺性巴氏桿菌根據(jù)莢膜抗原可以分為5種血清型，即A、B、D、E和F型，且不同血清型之間交叉免疫保護(hù)力較差，目前國(guó)內(nèi)家禽中主要流行的是A型[2]，因此對(duì)病原鑒定時(shí)有必要鑒定其血清型，為分子流行病學(xué)調(diào)查和疫苗候選株的選擇提供試驗(yàn)依據(jù)。

隨著集約化、放牧式養(yǎng)鴨的迅速發(fā)展，鴨巴氏桿菌病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，造成的危害越來(lái)越嚴(yán)重。雖然抗生素對(duì)于鴨霍亂的防治具有一定的療效，但普遍存在著停藥后容易復(fù)發(fā)的缺點(diǎn)，同時(shí)長(zhǎng)期用藥及濫用導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，因此，對(duì)地方分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對(duì)臨床合理用藥具有重要的指導(dǎo)作用。本研究通過(guò)細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定、小鼠致病性試驗(yàn)、PCR種屬及分型鑒定，確定病原菌為莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果為該分離菌株對(duì)大觀霉素、諾氟沙星等藥物敏感，可為臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 病料來(lái)源? 2018年1月湖北省監(jiān)利縣某鴨場(chǎng)260日齡的產(chǎn)蛋鴨，發(fā)病呈急性經(jīng)過(guò)，用氟苯尼考等抗生素治療，無(wú)明顯效果。剖檢發(fā)現(xiàn)，心包膜增厚、出血，肝臟腫大、表面有灰白色小點(diǎn)，脾臟腫大出血，各段腸黏膜出血。無(wú)菌采集心臟、肝臟等組織，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2? 培養(yǎng)基及試劑培養(yǎng)基? 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MAC）、水解酪蛋白培養(yǎng)基（MH）、小牛血清等，均購(gòu)自武漢潔洋盛科技有限公司;小量液體樣品核酸抽提試劑盒，購(gòu)自上海華舜生物技術(shù)有限公司;藥敏試驗(yàn)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株，大腸桿菌CMCC 44102，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心;抗菌藥物紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3? 試驗(yàn)小鼠? 昆明小鼠，體重為18～20 g，購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心。

1.2? 方法

1.2.1? 細(xì)菌的分離純化? 取無(wú)菌采集的病變組織同時(shí)涂抹在含5%小牛血清TSA和MAC平板上，并劃線，置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h。觀察菌落形態(tài)，挑取典型菌落革蘭氏染色、鏡檢，同時(shí)劃線接種含5%小牛血清TSA平板純化培養(yǎng)。

1.2.2? 生化鑒定? 對(duì)分離的病原菌株按常規(guī)方法進(jìn)行生化試驗(yàn)[3]。將所獲得分離菌的純培養(yǎng)菌落1～2個(gè)，分別接種于各微量生化發(fā)酵管內(nèi)，置37 ℃培養(yǎng)24～48 h，定時(shí)檢查反應(yīng)結(jié)果。

1.2.3? PCR擴(kuò)增鑒定

1）PCR引物合成。挑取TSA平板上純化菌落，提取細(xì)菌基因組作DNA模板，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成細(xì)菌16S rRNA通用引物，上游引物P1：5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′，下游引物P2：5′-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′;參照Townsend等[4]合成多殺性巴氏桿菌A、B、D、E、F莢膜血清型特異性基因引物capA、capB、capD、capE、capF。

2）PCR擴(kuò)增。種屬特異性PCR 20 μL反應(yīng)體系：2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）10 μL，無(wú)菌水8 μL，上、下游引物各1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。分型使用mPCR 方法，反應(yīng)條件與種屬特異性 PCR 反應(yīng)條件一致。

1.2.4? 致病性試驗(yàn)? 挑取純化的單個(gè)菌落接種于含5%小牛血清的TSB，37 ℃搖床培養(yǎng)12～18 h;采用表面培養(yǎng)測(cè)定法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，然后稀釋為2×108 CFU/mL。試驗(yàn)分為2組：試驗(yàn)組5只小鼠，每只腹腔注射菌液0.2 mL;對(duì)照組2只，每只腹腔注射無(wú)菌TSB 0.2 mL。觀察、記錄小鼠發(fā)病與死亡情況。死亡小鼠立即剖檢，觀察病變并進(jìn)行病原菌的分離鑒定。

1.2.5? 藥敏試驗(yàn)? 采用紙片擴(kuò)散（K-B）法進(jìn)行[5]。將分離菌的純培養(yǎng)物均勻涂布于MH培養(yǎng)基平板上，貼上15種藥敏紙片：大觀霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、頭孢曲松、阿米卡星、阿奇霉素、克林霉素、新霉素、鏈霉素、氟苯尼考、呋喃妥因、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、潔霉素，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察，量取抑菌圈的直徑，結(jié)果的判定按照抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）2010版。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 細(xì)菌分離純化

細(xì)菌在TSA平板上可見(jiàn)有單個(gè)灰白色、圓形、濕潤(rùn)、針尖大小的菌落，革蘭氏染色鏡檢為陰性球桿菌，且成對(duì)排列;而在MAC平板上無(wú)菌生長(zhǎng)。

2.2? 生化鑒定

葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、蔗糖、硫化氫、硝酸鹽還原為陽(yáng)性，木糖、山梨醇、麥芽糖、棉子糖、鼠李糖、乳糖、衛(wèi)矛醇、尿素酶、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（V-P）為陰性，符合多殺性巴氏桿菌特有的生化特征。

2.3? PCR擴(kuò)增鑒定

在460 bp處得到預(yù)期的目的條帶（圖1），將PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)，與多殺性巴氏桿菌同源性達(dá)99.88%。PCR檢測(cè)A、B、D、E、F莢膜血清型特異性基因，結(jié)果僅capA引物擴(kuò)增出了目的片段（1 044 bp），經(jīng)測(cè)序比對(duì)與莢膜血清A型的特異性基因（hyaD-hyaC）同源性達(dá)99.90%，其他引物對(duì)均未獲得擴(kuò)增片段。

根據(jù)分菌菌株的培養(yǎng)特性、形態(tài)特征和16 S rRNA序列比對(duì)及PCR分型鑒定結(jié)果，確定該分離菌株為莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌。

2.4? 致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)組的5只小鼠接種后8 h，均出現(xiàn)精神萎靡、食欲減退、腹瀉等癥狀，隨后在24～48 h內(nèi)全部陸續(xù)死亡;而對(duì)照組2只小鼠無(wú)發(fā)病和死亡，全部健康。無(wú)菌采取死亡小鼠心血制成涂片后革蘭氏染色鏡檢，同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。鏡檢可見(jiàn)大量革蘭氏陰性球桿菌，在大小、形態(tài)特征、排列方式、染色特性上均與初次分離菌株以及接種菌株基本相同。

2.5? 藥敏試驗(yàn)

從表1中可看出，該菌株對(duì)大觀霉素高度敏感，對(duì)諾氟沙星、氧氟沙星、阿米卡星、新霉素、克林霉素、阿奇霉素等中度敏感，對(duì)頭孢曲松、鏈霉素、復(fù)方新諾明、磺胺異惡唑、氟苯尼考、四環(huán)素、呋喃妥因、潔霉素等耐藥。

3? 討論

鴨霍亂是由多殺性巴氏桿菌引起的一種接觸性傳染病，特點(diǎn)是發(fā)病快、發(fā)病率和死亡率高，主要通過(guò)呼吸道和消化道傳染;飼養(yǎng)管理不當(dāng)和環(huán)境惡劣是該病的主要誘因。本研究對(duì)一例急性死亡病鴨進(jìn)行細(xì)菌分離，將常規(guī)的生化試驗(yàn)與分子生物學(xué)鑒定手段相結(jié)合，能夠快速準(zhǔn)確地判斷病因，為臨床診斷和治療提供可靠依據(jù)。通過(guò)莢膜血清型的PCR鑒定，確定其為莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌，與文獻(xiàn)報(bào)道的鴨霍亂病例的血清型一致[6，7]，說(shuō)明莢膜血清A型仍然是國(guó)內(nèi)家禽中多殺性巴氏桿菌主要流行的血清型。近年來(lái)，鴨霍亂的發(fā)病率逐漸上升，且性成熟的鴨最易感，而母源性抗體不能起到有效保護(hù)作用，利用地方分離菌株制備自價(jià)滅活苗有較好的預(yù)防效果[8，9]。

為了解發(fā)病地區(qū)多殺性巴氏桿菌的耐藥情況，對(duì)分離菌株進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，耐藥情況非常嚴(yán)重，15種抗生素藥物中，高度敏感的只有1種藥物，高敏率為6.67%（1/15），耐藥率達(dá)到53.33%（8/15），這與養(yǎng)殖場(chǎng)用藥不規(guī)范及濫用有關(guān)。由于不同地區(qū)存在著流行菌株與抗生素使用情況的差異，導(dǎo)致多殺性巴氏桿菌的地區(qū)分離菌株耐藥性也存在著差異[10，11]，極大地增加了治療時(shí)藥物選擇的難度，應(yīng)引起足夠重視。

防控鴨霍亂的最有效措施是采取防治結(jié)合、防重于治的原則，做好養(yǎng)殖環(huán)境的隔離、衛(wèi)生消毒工作，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，避免潮濕、擁擠、營(yíng)養(yǎng)缺乏等不良應(yīng)激因素的影響，增強(qiáng)鴨個(gè)體機(jī)體抵抗力，積極采取疫苗免疫預(yù)防，從而減少或杜絕疾病的發(fā)生。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、及時(shí)用藥和準(zhǔn)確用藥也是關(guān)鍵，如果發(fā)病初期及時(shí)采取藥物、疫苗給予控制，并將病鴨隔離，無(wú)害化處理死亡鴨，用生石灰水等消毒劑進(jìn)行場(chǎng)地和器械徹底消毒，則疫情可以得到迅速控制。

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收稿日期：2019-01-03

作者簡(jiǎn)介：王紅琳（1966-），女，江蘇海安人，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事畜禽傳染病預(yù)防及生物制品研發(fā)工作，