新型香菇母種培養(yǎng)基的篩選

楊煥玲　查磊　趙妍　黃建春　雋加香　陳明杰

摘要：以香菇菌株18為材料，通過對不同培養(yǎng)基的香菇菌絲生長狀況的評價、菌絲生長速度及生物量的分析，以篩選出新型的香菇母種培養(yǎng)基。結(jié)果表明，與基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基相比，添加海藻糖的新型培養(yǎng)基對香菇菌絲的生長具有一定的積極作用，能夠促進菌絲的生長速度，有助于菌絲生物量的增加，但不改變其蛋白質(zhì)組成。綜合來看，PDTA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖10 g，海藻糖10 g，蒸餾水1 000 mL）、PTA-2培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，海藻糖20 g，蒸餾水1 000 mL）更適合香菇18菌絲的培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：香菇;培養(yǎng)基;生長速度;生物量;SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）

中圖分類號： S646.1+20.4? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0124-03

香菇（Lentinula edodes）在分類學(xué)上屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 、傘菌綱（Agaricomycetes） 、傘菌目（Agaricales） 、光茸菌科（Omphalotaceae）、香菇屬（Lentinula）（Available online：http：//www.mycobank.org/）。香菇味道鮮美，肉質(zhì)細嫩，具有獨特的香氣和豐富的營養(yǎng)，含有較高的蛋白質(zhì)、維生素以及多種類型的礦質(zhì)元素，有著山珍、菇中之王等美稱[1-2]。香菇具有延緩衰老、防癌抗癌、降血脂血壓及膽固醇、提高機體免疫功能等作用[3]，因此香菇具有很高的食用價值，市場廣闊，是世界上第二大食用菌，提高其產(chǎn)量及品質(zhì)具有重要意義[4]。

食用菌的培養(yǎng)基是保藏菌種的關(guān)鍵，同時也是生產(chǎn)上獲得高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要前提[5-6]。目前，香菇常使用的固體培養(yǎng)基主要為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）[7]，同時也存在其他少數(shù)類型的培養(yǎng)基，例如用農(nóng)副產(chǎn)品或金銀花藤浸出液制作的香菇母種培養(yǎng)基[8-9]，富硒香菇液體培養(yǎng)基[10-11]，產(chǎn)多糖的液體發(fā)酵培養(yǎng)基[12]，碳源、氮源等優(yōu)化的香菇培養(yǎng)基[13-14]等。海藻糖是一種非還原性二糖，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，能夠增強生物體對高溫、脫水、干旱、冷凍、高滲透性、重金屬及有毒試劑等逆境的抵抗能力[15]。通過外源添加的方式，海藻糖在菌體外部形成保護膜，能起到較好的非特異性保護細胞，使生物膜和蛋白質(zhì)等在不良環(huán)境中免受傷害，并且使菌體不受自身代謝產(chǎn)物影響的作用[16-17]。本試驗采用添加海藻糖的培養(yǎng)基，對香菇18菌株進行培養(yǎng)，將它與常用的基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基進行比較，篩選最佳培養(yǎng)基，不僅豐富了生產(chǎn)上的培養(yǎng)基種類，也在菌種保藏、交替使用培養(yǎng)基防止菌種退化及菌種抗逆等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

香菇菌株18由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基種類

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水 1 000 mL。

PDTA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖10 g，海藻糖10 g，蒸餾水1 000 mL。

PDTA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，海藻糖 10 g，蒸餾水1 000 mL。

PTA-2固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，海藻糖 20 g，蒸餾水1 000 mL。

PTA-2液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，海藻糖20 g，蒸餾水 1 000 mL。

PTA-5固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，海藻糖 50 g，蒸餾水1 000 mL。

PTA-5液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，海藻糖50 g，蒸餾水 1 000 mL。

1.3 固體及液體培養(yǎng)方法

所有培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min，冷卻后待接種。在紫外線滅菌30 min后的超凈工作臺上，選用相同生長狀況的香菇菌絲進行接種。固體培養(yǎng)在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下進行培養(yǎng)，液體培養(yǎng)在25 ℃、150 r/min轉(zhuǎn)速的恒溫搖床中黑暗條件下進行培養(yǎng)。

1.4 香菇菌絲生長情況及蛋白組成的測定

1.4.1 菌絲生長狀態(tài)及生長速度的測定 在長滿菌絲的PDA固體培養(yǎng)基上，分別用直徑為5 mm的打孔器沿菌落邊緣打孔，將菌塊接種于不同類型的固體培養(yǎng)基上，在25 ℃黑暗條件下進行培養(yǎng)，每天定時觀察菌絲的生長形態(tài)[18]。分別在接種后培養(yǎng)4、6、8 d用十字交叉法測量菌落半徑，菌落半徑差值（mm）與生長時間（d）的比值即為菌絲生長速度（mm/d）。每組重復(fù)3次，計算菌絲平均生長速度并且在培養(yǎng)10 d時對菌絲菌落形態(tài)進行拍照。

1.4.2 菌絲生物量的測定 接種后的液體培養(yǎng)基在25 ℃恒溫搖床中黑暗條件下培養(yǎng)到10 d時，菌絲基本長滿搖瓶，處于生長旺盛階段，10 d時收集香菇菌絲。用烘干至恒質(zhì)量（m1）的濾紙過濾，將菌絲體與濾紙共同烘干至恒質(zhì)量（m2），計算菌絲體干質(zhì)量m=m2-m1，每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.4.3 SDS-PAGE電泳分析 將在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d的菌絲進行收集，采用TCA（三氯乙酸）/丙酮法提取蛋白質(zhì)，并用濃度為12.5%的凝膠進行SDS-PAGE電泳分析蛋白質(zhì)組成。

2 結(jié)果與分析

2.1.1 不同培養(yǎng)基對香菇菌絲生長狀況的影響? 將接種后的培養(yǎng)皿置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)，分別在接種后4、6、8、10 d比較觀察菌絲生長狀態(tài)，記錄菌絲色澤、邊緣整齊度以及菌落長勢，并劃分如下長勢等級：菌絲潔白粗壯，菌落濃密，菌絲分支多且密，長勢好，邊緣整齊則標記為+ + +;菌絲中等粗壯，菌落濃密，微黃，菌絲分支中等，邊緣較整齊記為+ +;菌絲纖細絨毛狀，微黃至黃褐色，菌落稀疏，邊緣不整齊則記為+[19]。

香菇在4種培養(yǎng)基上10 d的生長狀況見圖1，菌絲生長狀況評價見表1。香菇菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長狀況良好，菌絲潔白微黃，菌落較稀疏，菌絲中等粗壯且分支中等，邊緣整齊;在PDTA培養(yǎng)基上長勢較好，菌絲潔白微黃，菌絲中等粗壯且菌落較濃密，菌落邊緣整齊;在PTA-2培養(yǎng)基上長勢最好，菌絲潔白粗壯，菌落濃密，菌絲分支多且密，邊緣整齊;在PTA-5培養(yǎng)基上長勢良好，菌絲潔白微黃，菌落較濃密，菌絲分叉多，邊緣整齊。

2.1.2 不同培養(yǎng)基對香菇菌絲生長速度的影響 香菇在不同的培養(yǎng)基上的菌絲生長速度測定結(jié)果（圖2）表明，添加海藻糖的培養(yǎng)基對菌絲的生長速度具有不同程度的提高作用。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基PDA為對照，添加海藻糖的培養(yǎng)基中菌絲生長速度與對照具有顯著性差異，其中PDTA培養(yǎng)基中菌絲生長速度與對照具有極顯著性差異。

2.1.3 不同培養(yǎng)基對香菇菌絲生物量的影響 香菇在不同液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌絲生物量測定結(jié)果（圖3）表明，添加海藻糖的培養(yǎng)基對菌絲生物量具有不同程度的提高作用。與對照相比，香菇在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的生物量均有一定程

度提高，但均未達到顯著性差異。

2.1.4 SDS-PAGE電泳 收集不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的香菇菌絲，采用TCA/丙酮法提取蛋白質(zhì)后進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果（圖4）表明，新培養(yǎng)基的菌絲蛋白質(zhì)條帶組成與基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲蛋白質(zhì)條帶組成無區(qū)別， 說明添加海藻糖的培養(yǎng)基并不會改變香菇菌絲的蛋白質(zhì)組成。

3 討論與結(jié)論

香菇新型母種培養(yǎng)基的篩選對香菇菌種的保藏以及生產(chǎn)上高產(chǎn)的穩(wěn)定性具有重要影響。添加海藻糖的培養(yǎng)基能為香菇菌絲生長提供良好的營養(yǎng)和空間環(huán)境，且制作方法簡單，能夠顯著加快菌絲的生長，一定程度上提高菌絲生物量，具有間接增加經(jīng)濟效益的潛力。海藻糖作為一種穩(wěn)定的非還原性二糖，具有防止蛋白質(zhì)變性[20]的作用，而且積累到一定的水平，會響應(yīng)于高溫[21-22]、碳和氮饑餓[23-25]、氧自由基[26]、脫水[27-28]、冷脅迫[29]、冷凍[28]、甲苯及乙醇[30] 等引發(fā)的脅迫性應(yīng)激[20，31-32]。添加海藻糖培養(yǎng)基的使用，不但能夠為香菇菌絲提供營養(yǎng)來源，而且有助于增強香菇菌絲在培養(yǎng)過程中應(yīng)對脅迫條件的能力。試驗以普通PDA培養(yǎng)基為對照，對不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的香菇菌絲生長狀況進行評價，對菌絲生長速度及生物量進行分析，結(jié)果表明，香菇菌絲較適合在PDTA培養(yǎng)基、PTA-2培養(yǎng)基上生長。綜上，本試驗中香菇新型母種培養(yǎng)基可以為深入開展食用菌菌種保藏技術(shù)提供參考，同時也揭示了外源添加海藻糖的培養(yǎng)基具有一定的開發(fā)潛力。

參考文獻：

[1]戴玉成，楊祝良. 中國藥用真菌名錄及部分名稱的修訂[J]. 菌物學(xué)報，2008，27（6）：801-824.

[2]劉春如，易 誠. 香菇的營養(yǎng)價值和藥用價值[J]. 中國林副特產(chǎn)，2002 （1）：52-53.

[3]楊新美. 中國食用菌栽培學(xué)[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1988.

[4]毛賽飛，潘育東，陳昌鳳. 為害香菇的癭蚊特征、特性和生活史[J]. 食藥用菌，2017，25（2）：143-144.

[5]徐瑞雅，齊志廣，賈耐兵，等. 食用菌最佳母種培養(yǎng)基的篩選[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，11（1）：23-24.

[6]趙俊霞，王立安，齊志廣. 四種食用菌母種培養(yǎng)基的篩選[J]. 食用菌，2003，25（2）：18，20.

[7]何培新，張定法，孟 麗，等. 食用菌母種培養(yǎng)基的試劑化制備及應(yīng)用[J]. 中國食用菌，2000，19（2）：7-8.

[8]李秋信，苑建芳，李振智，等. 金銀花藤香菇母種培養(yǎng)基優(yōu)化試驗[J]. 食用菌，2018，40 （3）：43-44，65.

[9]何培新，張定發(fā)，孟 麗，等. 食用菌母種培養(yǎng)基的試劑化制備及應(yīng)用效果[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，29（1）：22-23.

[10]李翠麗，陳文強，喬艷明. 秦巴山區(qū)低溫型香菇的硒耐受力及富硒液體培養(yǎng)基優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技，2017，38（10）：189-193.

[11]彭 浩，喬艷明，陳文強，等. 用L9（34）正交實驗篩選富硒香菇液體培養(yǎng)基[J]. 北方園藝，2014（15）：152-157.

[12]馬銀鵬，于麗萍，馬 鳴，等. 香菇液體培養(yǎng)基優(yōu)化及其體外抗氧化活性研究[J]. 食品研究與開發(fā)，2017，38（16）：10-14.

[13]覃寶山，覃勇榮，黃春鳳，等. 香菇培養(yǎng)基主要營養(yǎng)物質(zhì)篩選及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 中國園藝文摘，2017，33（8）：1-4.

[14]秦秀麗. 香菇菌種液體培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 特產(chǎn)研究，2008，30（4）：49-50.

[15]冷亞君. 海藻糖及真菌海藻糖酶的研究現(xiàn)狀與展望[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（5）：79-82.

[16]王 芳，康 超，林 靜，等. 海藻糖對乳酸桿菌耐熱和室溫貯存保護作用的研究[J]. 中國飼料，2017 （10）：17-19.

[17]張?zhí)m馨，張部昌. 海藻糖分子的細胞保護作用研究進展[J]. 中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2008，3（6）：465-467.

[18]楊 慧，尚曉冬，王瑞霞，等. 蒸餾水與液氮保藏金針菇菌種特性的比較[J]. 食用菌學(xué)報，2010，17（4）：23-25.

[19]朱翠玲. 中國新記錄種鱗柄傘Agaricus flocculosipes急性毒性、營養(yǎng)成分及培養(yǎng)特性研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[20]Hallsworth J E，Magan N. Effects of KCl concentration on accumulation of acyclic sugar alcohols and trehalose in conidia of three entomopathogenic fungi[J]. Letters in Applied Microbiology，1994，18（1）：8-11.

[21]Eleutherio E C A，Araujo P S，Panek A D. Role of the trehalose carrier in dehydration resistance of Saccharomyces cerevisiae[J]. Biochim Biophys Acta，1993，1156（3）：263-266.

[22]Hottiger T，Virgilio C D，Hall M N，et al. The role of trehalose synthesis for the acquisition of thermotolerance in yeast. Ⅱ. Physiological concentrations of trehalose increase the thermal stability of proteins in vitro[J]. Eur J Biochem，1994，219（1/2）：187-193.

[23]Parrou J L，Enjalbert B，Plourde L，et al. Dynamic responses of reserve carbohydrate metabolism under carbon and nitrogen limitations in Saccharomyces cerevisiae[J]. Yeast，1999，15（3）：191-203.

[24]Pinho C A D，Lourdes M D，Polizeli T M，et al. Mobilisation of trehalose in mutants of the cyclic AMP signalling pathway，cr-1 （CRISP-1） and mcb （microcycle conidiation），of Neurospora crassa[J]. Fems Microbiology Letters，2001，199（1）：85-89.

[25]Fillinger S，Chareroche M K，Dijck P V，et al. Trehalose is required for the acquisition of tolerance to a variety of stresses in the filamentous fungus Aspergillus nidulans[J]. Microbiology，2001，147（7）：1851-1862.

[26]Benaroudj N，Lee D H，Goldberg A L. Trehalose accumulation during cellular stress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals[J]. The Journal of Biological Chemistry，2001，276（26）：24261-24267.

[27]Crowe J H，Crowe L M，Chapman D. Preservation of membranes in anhydrobiotic organisms：the role of trehalose[J]. Science，1984，223（4637）：701-703.

[28]Shima J，Hino A，Yamada-Iyo C，et al. Stress Tolerance in doughs of Saccharomyces cerevisiae trehalase mutants derived from commercial bakers yeast[J]. Applied & Environmental Microbiology，1999，65（7）：2841-2846.

[29]Robinson C H. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi[J]. New Phytologist，2001，151（2）：341-353.

[30]Bhaganna P，Volkers R J M，Bell A N，et al. Hydrophobic substances induce water stress in microbial cells[J]. Microbial Biotechnology，2010，3（6）：701-716.

[31]Harman G E，Jin X，Stasz T E，et al. Production of conidial biomass of Trichoderma harzianum for biological control[J]. Biological Control，1991，1（1）：23-28.

[32]Kar J R，Hallsworth J E，Singhal R S. Fermentative production of glycine betaine and trehalose from acid whey using Actinopolyspora halophila （MTCC 263）[J]. Environmental Technology & Innovation，2015，3：68-76.朱 磊，胡 婷，劉德明，等. 葉面噴施硒對蘿卜硒吸收及抗氧化能力的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（3）：127-131.