飼料中添加根瘤菌對凡納濱對蝦生長和抗氧化酶活力的影響

管振國 竇勇 于士國 周文禮 邵蓬 高金偉 賈旭穎

摘? ? 要：通過在凡納濱對蝦基礎(chǔ)飼料中添加根瘤菌制劑，研究根瘤菌對對蝦生長性能和抗氧化酶活力的影響。結(jié)果表明，試驗組中對蝦生長指標(biāo)及血清、肝胰臟中抗氧化酶活力均比對照組有所提高，其中酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、堿性磷酸酶（AKP）活性顯著增強（P<0.05）。因此，飼料中添加根瘤菌可以促進凡納濱對蝦生長，提高對蝦存活率、肥滿度和特定生長率，降低餌料系數(shù)，提高抗氧化酶活性，增強其抗病能力。通過在飼料中添加不同濃度根瘤菌的對比試驗，最終確定飼料中添加根瘤菌的最適劑量為2 g·kg-1。

關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦;根瘤菌;生長;抗氧化酶

中圖分類號：S96? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.07.010

Abstract： Growth and antioxidase activities of Litopenaeus vannamei were studied through Rhizobium adding in the basic fodder. The results indicated that， the growth indicators and antioxidase activities in serum and hepatopancreas of Litopenaeus vannamei in the test groups were higher than the control group， and especially the activities of PO， SOD and AKP were higher than the control group significantly（P<0.05）. According to the results， the survival rate， fullness， specific growth rate and antioxidase activities increased through Rhizobium adding in the basic fodder， while the feed coefficient decreased simultaneously. According to the experiment， the optimal addition in the basic fodder was 2 g·kg-1.

Key words： Litopenaeus vannamei; rhizobium; growth indicators; antioxidase activities

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei），也稱為南美白對蝦，屬有鰓亞門、甲殼綱、十足目、對蝦科、對蝦屬，原產(chǎn)于中南太平洋海岸水域秘魯北部至墨西哥桑諾拉，于1988年由中科院海洋研究所張偉權(quán)教授引進，后來逐漸在我國由南向北進行實驗推廣并獲得成功，現(xiàn)已發(fā)展成為我國養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的經(jīng)濟蝦類[1]。但隨著養(yǎng)殖體量的不斷提高，帶病蝦苗和高密度養(yǎng)殖帶來的病害給凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了嚴重損失，而使用化學(xué)藥物防治病害又產(chǎn)生了藥殘等二次污染，因此，綠色環(huán)保的微生態(tài)制劑成為化學(xué)藥物的理想替代品。歸納來說，微生態(tài)制劑的功能主要有：調(diào)節(jié)養(yǎng)殖生物腸道菌群平衡;微生態(tài)制劑的生物組份分泌抑菌物質(zhì)抑制病原菌繁殖;生物組份在特定環(huán)境下產(chǎn)生各種消化酶，促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收及利用;提高飼料利用率;具有良好的免疫原性，可以激活非特異性免疫因子活性[2-3]。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的益生菌種類繁多，主要有EM菌、乳酸菌（Lactic acid bacteria）、光合細菌（Photosynthetic bacteria）、芽孢桿菌（Bacillus bacteria）、硝化細菌（Nitrifying bacteria）和丁酸梭菌（Clostridium butyricum）等[4-7]。根瘤菌是變形菌門、根瘤菌目、根瘤菌科微生物的統(tǒng)稱，可以與豆科植物共生并能固定空氣中氮素的一類革蘭氏陰性菌。目前，根瘤菌在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用已有許多研究，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用至今少見報道，目前僅有李海兵[8]研究發(fā)現(xiàn)，根瘤菌對中國對蝦（Penaeus chinensis）仔蝦的腸道具有保護作用，是對蝦養(yǎng)殖過程中的一種潛在益生菌。項目組前期對根瘤菌的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，大幅提高了細菌培養(yǎng)效率并降低了使用成本。為了進一步挖掘根瘤菌作為微生態(tài)制劑的效能，本研究通過在凡納濱對蝦基礎(chǔ)飼料中添加根瘤菌制劑，分析對蝦生長和抗氧化酶活性變化，為根瘤菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的合理應(yīng)用提供一定的數(shù)據(jù)支持和試驗證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與裝置

試驗于河北省唐山市金鵬養(yǎng)殖基地進行，試驗材料選用泰國正大自交系的F1代蝦苗，對蝦基礎(chǔ)餌料購于唐山金鵬飼料有限公司。選取18個養(yǎng)殖池（規(guī)格為5 m×6 m×1.4 m）作為試驗場所，分成6組，編號分別為對照組C1和試驗組C2，C3，C4，C5，C6，每組設(shè)3個重復(fù)。制作直徑為1.3 m、高度1.5 m的網(wǎng)箱18個，分成6組，分別編號為對照組QC和試驗組QS0.5、QS1、QS2、QS3和QS4，每組設(shè)3個重復(fù)。養(yǎng)殖池與網(wǎng)箱相對應(yīng)，即C1池對應(yīng)QC組，C2池對應(yīng)QS0.5組，以此類推。

1.2 飼養(yǎng)管理

蝦苗培育至體長3.5 cm左右，蝦苗初始體質(zhì)量（0.72 ± 0.01 ）g·尾-1，對蝦標(biāo)粗結(jié)束后，隨機選取300尾凡納濱對蝦稱質(zhì)量后放入網(wǎng)箱中。為保證網(wǎng)箱試驗環(huán)境同實際生產(chǎn)環(huán)境的一致性，每個網(wǎng)箱距池壁1.5 m。養(yǎng)殖用水為過濾的天然海水，鹽度為（29 ±1）‰，水溫為（28 ± 2） ℃，溶氧為（7.3±0.3）mg·L-1。每天投餌4次（分別在06：00、10：00、14：00、22：00），投喂量為對蝦體質(zhì)量的6%～10%。養(yǎng)殖前期（0～4周）每天換水量為池水的1/4～1/3，中后期（5～8周）每天換水量為池水的1/3～1/2。整個試驗僅在投餌期間停止曝氣，投喂餌料1 h后恢復(fù)曝氣。

1.3 試驗設(shè)計

投喂餌料2 h前，先將根瘤菌兌水稀釋5倍后再和飼料充分攪拌，根瘤菌在飼料中添加的劑量分別為0，0.5%，1.0%，2.0%，3.0%和4.0%，與之相對應(yīng)的網(wǎng)箱編號為QC組、QS0.5組、QS1組、QS2組、QS3組和QS4組。每次投喂后40 min利用虹吸管收集網(wǎng)箱中殘餌，經(jīng)烘箱70 ℃烘干后記錄投喂量和殘餌量，每周稱質(zhì)量1次，用以矯正投餌率，記錄投餌量。每周檢測水體pH值、氨氮、亞硝酸鹽，總氮和硝酸鹽濃度。試驗周期為56 d。

1.4 凡納濱對蝦生長指標(biāo)測定

稱取每個網(wǎng)箱中凡納濱對蝦總質(zhì)量并記錄終末存活數(shù)Nf，用于計算成活率;隨機抽取15尾對蝦稱質(zhì)量，測量體長，用于計算肥滿度;在冰盤上解剖分離肝胰臟用濾紙洗掉水分后稱質(zhì)量，用于計算肝體比。各指標(biāo)計算公式如下：

1.5 凡納濱對蝦血清和肝胰臟中抗氧化酶測定

在網(wǎng)箱中隨機抽取15尾對蝦取血，取血部位在對蝦的第5步足基部血竇中。血液放置于1.5 mL離心管中，為防止凝固，在離心管內(nèi)加入適量抗凝劑，在冰箱內(nèi)（4 ℃）放置24 h，然后以5 000 r·min-1離心10 min，取其上清液置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)待測。再將15尾對蝦在冰盤上取出肝胰腺，用濾紙吸干水分后稱重后置于10 mL離心管中，加入9倍體積勻漿介質(zhì)，冰浴勻漿，冷凍離心（4 ℃，10 000 r·min-1，10 min），取上清液分裝于1.5 mL離心管中，用于超氧化物歧化酶（SOD）、酚氧化酶（PO）、過氧化氫酶（CAT）和堿性磷酸酶（AKP）測定。

將每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量定義為一個SOD酶活力單位（U）;將反應(yīng)體系中OD490每分鐘增加0.001定義為一個PO酶活力單位（U）;將每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol H2O2的量定義為一個CAT酶活力單位（U），將每克組織蛋白在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚定義為1個AKP酶活力單位（U）。SOD、PO、CAT活性以酶活單位·毫克蛋白-1（U·mg-1）表示，AKP活性以酶活單位·克蛋白-1（U·g-1）表示。所有指標(biāo)測試方法均參照商品化試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）進行，吸光度值使用UV-1240紫外-可見分光光度計測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

對蝦生長指標(biāo)和抗氧化酶活力數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。其中對蝦生長指標(biāo)使用單因素方差分析（one-way ANOVA），抗氧化酶活性使用配對T檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加根瘤菌對凡納濱對蝦生長的影響

由表1可知，在凡納濱對蝦成活率方面QS0.5組極顯著高于對照組（P<0.01），其他試驗組雖都有所提高，但沒有出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在肥滿度、增重率、餌料系數(shù)和特定生長率方面QS2極顯著高于對照組（P<0.01），肥滿度、增重率、餌料系數(shù)和特定生長率分別為（5.72±0.12）%、（818.16±7.93）%、（1.08±0.07）和（5.92±4.04）%，且肥滿度、增重率和特定生長率出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢。通過以上數(shù)據(jù)和實際生產(chǎn)的需求，最終確定根瘤菌在飼料中的最適添加量為2 g·kg-1。

2.2 飼料中添加根瘤菌對凡納濱對蝦抗氧化酶活性的影響

2.2.1 對凡納濱對蝦SOD活性的影響 餌料添加根瘤菌對凡納濱對蝦肝胰腺和血清中SOD活性的影響如圖1所示。QS2組血清中SOD活力為46.5 U·mg-1，QS1組肝胰腺中SOD活力為27.5 U·mg-1，均顯著高于對照組（P<0.05），血清中SOD活性隨根瘤菌添加量的變化出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

2.2.2 對凡納濱對蝦PO活性的影響 餌料中添加根瘤菌對凡納濱對蝦血清PO活性的影響見圖2。隨根瘤菌添加量的增加，雖然對蝦血清和肝胰腺中PO活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，但血清中PO活力同對照組相比不顯著（P>0.05），而QS2組肝胰腺中PO活性達到最高值為2.71 U·mg-1，進一步驗證了根瘤菌在飼料中的最適添加量為2 g·kg-1。2.2.3 對凡納濱對蝦CAT活性的影響 餌料中添加根瘤菌對凡納濱對蝦肝胰腺和血清中CAT活性的影響如圖3所示。隨根瘤菌添加量的增加，對蝦血清和肝胰腺中過氧化氫酶CAT活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。試驗組均顯著高于對照組（P<0.05）。CAT活力最高值出現(xiàn)在QS1組，血清中CAT活性最高值為4.25 U·mg-1，而肝胰腺中CAT活性峰值為6.10 U·mg-1。

2.2.4 對凡納濱對蝦AKP活性的影響 餌料添加根瘤菌對凡納濱對蝦肝胰腺和血清中AKP活性的影響如圖4所示，血清中AKP活性隨根瘤菌添加量的增加不斷升高，而肝胰腺中AKP活力隨根瘤菌添加量的增加出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。試驗組肝胰腺中AKP活性較對照組差異顯著（P<0.05），肝胰腺中AKP活性最強的出現(xiàn)在QS2組，達3.2 U·g-1。

3 討 論

3.1 飼料中添加根瘤菌對凡納濱對蝦生長性能的影響

在添加不同微生態(tài)制劑用于大菱鲆、草魚、吉富羅非魚的試驗結(jié)果均表明，微生態(tài)制劑都能促進水產(chǎn)養(yǎng)殖動物生長，提高其生長性能[9-11]。在青魚基礎(chǔ)飼料中添加不同濃度的枯草芽抱桿菌8周后，試驗組青魚終體質(zhì)量和魚體增質(zhì)量均顯著高于對照組（P<0.05），而餌料系數(shù)顯著低于對照組（P<0.05）[12]。有研究證實[13]，將兩株枯草芽孢桿菌作用于凡納濱對蝦，對蝦增重率和特定生長率均顯著提高（P<0.05）。有研究指出[14]，菌株的品種、活性、培養(yǎng)條件、添加濃度、投喂方式和飼養(yǎng)環(huán)境條件等都會使益生菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的作用效果產(chǎn)生差異。微生態(tài)制劑自身可以提供一部分可吸收蛋白，同時還有利于促進飼料中蛋白質(zhì)的消化、吸收。有研究者發(fā)現(xiàn)[8]，根瘤菌有助于改善中國對蝦仔蝦腸道健康狀況，促進營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，利于對蝦生長，這與本研究的結(jié)論一致。本研究的試驗結(jié)果證實，飼料中添加根瘤菌有利于提高凡納濱對蝦的肥滿度、增重率、特定生長率并降低餌料系數(shù)。在成活率方面，試驗組較對照組差異不顯著（P>0.05），這與保苗結(jié)束后對蝦體質(zhì)相對較好同時成活率較高有關(guān)，通過這一點也恰恰反映了養(yǎng)殖初期保苗的重要性[15]。試驗組對蝦的餌料系數(shù)出現(xiàn)了先降低后升高的趨勢，說明飼料中添加根瘤菌有利于降低餌料系數(shù)，但并不是添加量越多越好，根據(jù)試驗最終確定根瘤菌的最適添加量為2 g·kg-1。

3.2 飼料中添加根瘤菌對肝胰腺和血清中抗氧化酶活性的影響

本試驗研究了飼料中添加根瘤菌對凡納濱對蝦血清和肝胰腺中SOD、PO、CAT和AKP活性的影響。這4種酶在甲殼動物非特異性免疫中發(fā)揮了重要作用，其中SOD和CAT是機體內(nèi)的抗氧化酶，在清除超氧自由基，防止生物大分子損傷方面發(fā)揮重要的生理作用[16];酚氧化酶原系統(tǒng)是對蝦防御和識別的重要系統(tǒng)[2];AKP是動物體內(nèi)重要的解毒酶類[17]。已有研究表明，添加益生菌可以提高水產(chǎn)動物的非特異性免疫活力。黃美珍[18]將光和細菌拌入中國對蝦的飼料，經(jīng)過22 d試驗發(fā)現(xiàn)蝦體PO、SOD和溶菌酶活力均比對照組顯著提高，本研究也得到了相似的結(jié)論。試驗結(jié)果表明，根瘤菌處理后凡納濱對蝦血清和肝胰腺中SOD、PO、CAT、AKP 4種酶的活力較對照組均有所提高，其中SOD、CAT活性隨著根瘤菌添加量的不同表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，尤其是SOD活性較對照組差異顯示不斷上升的趨勢，這可能與根瘤菌與腸道內(nèi)有害菌群競爭有關(guān)，其內(nèi)在作用機理需要進一步研究。這說明凡納濱對蝦飼料中添加根瘤菌，可以提高血清和肝胰腺中相關(guān)免疫酶的活性，這與SOD和PO在體內(nèi)清除超氧自由基，防止生物分子損傷的作用有關(guān)，提高了凡納濱對蝦機體免疫力和肝胰腺的消化能力，減少疾病的發(fā)生。

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