植物單寧細胞研究進展

黃海娜　程大偉　顧紅　張洋　郭西智　陳錦永

摘要：單寧細胞普遍存在于植物的各個部位，具有保護植物免受逆境傷害的功能，其內(nèi)含物主要成分（單寧）在制革、醫(yī)藥、食品、材料及化工等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值，已成為近年來國內(nèi)外的研究熱點。筆者綜合國內(nèi)外研究報道，就單寧細胞的基本特征、觀察方法及影響其形成的因素展開論述，闡述了其與果實澀味及果實脫澀的關(guān)系，并對今后單寧的研究方向進行了展望，旨在為單寧細胞的研究提供有價值的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：單寧細胞;基本特征;果實澀味;觀察方法

中圖分類號： S184? 文獻標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0029-05

單寧，又名單寧酸、鞣酸，廣泛存在于植物的根、莖、葉、果實及樹皮等部位，是相對分子質(zhì)量為500～3 000 u的多酚化合物[1]。根據(jù)單寧的溶解性，可將其分為可溶性單寧和不溶性單寧[2]，其中可溶性單寧被認為是引起澀味的主要物質(zhì)，其與人體口腔黏膜蛋白結(jié)合產(chǎn)生強烈的收斂性，引起“澀感”[3]。單寧類物質(zhì)并不是所有植物細胞都含有，而是存在于一種特殊細胞中，這種特殊細胞被稱為單寧細胞[4]。當(dāng)咬破果實時，單寧細胞破裂，可溶性單寧流出，與唾液蛋白結(jié)合，使人感到強烈的澀味。單寧具有抗氧化、抑菌等生理活性，在制革、化妝品、食品工業(yè)、醫(yī)藥等方面有很高的應(yīng)用價值[5]。因此，前人多注重于植物單寧的提取、抗氧化能力、含量變化以及與澀味的關(guān)系等方面的研究[6-9]，而對單寧細胞的研究缺少系統(tǒng)報道。筆者綜合國內(nèi)外研究報道，就單寧細胞的觀察方法、基本特征及與果實澀味的關(guān)系展開論述，以期為單寧細胞研究者提供一些有價值的參考。

1 單寧細胞的基本特征

單寧細胞在大小、體積、形態(tài)及分布上均表現(xiàn)出多樣性，不僅在樹種間和品種間有所不同，而且同一果實內(nèi)不同部位的單寧細胞也存在差異，并且隨著果實的發(fā)育發(fā)生著相應(yīng)的變化。

1.1 單寧細胞的大小和密度

不同植物或同一植物不同部位的單寧細胞大小和密度均不相同。單寧細胞存在于所有植物中，但至今對柿果實的單寧細胞研究最為透徹，張寶善等研究發(fā)現(xiàn)，成熟期的柿果實單寧細胞要比幼果期的大3倍左右，在果實生長發(fā)育過程中，澀柿單寧細胞的體積和密度隨果實生長逐漸增大，且均大于甜柿，在果實發(fā)育后期，甜柿單寧細胞呈現(xiàn)停滯生長狀態(tài)，而澀柿單寧細胞持續(xù)生長直至成熟[10]。費學(xué)謙等研究發(fā)現(xiàn)，成熟期澀柿單寧細胞面積占果肉總面積的11%以上，而甜柿單寧細胞僅占3%左右[11]。楊勇等研究發(fā)現(xiàn)，單寧細胞的縱橫徑隨果實生長逐漸增大，其中縱徑增大顯著，橫徑增大緩慢，完全甜柿的單寧細胞縱橫徑在同期均比完全澀柿小[12]。章鎮(zhèn)等研究發(fā)現(xiàn)，果實成熟后期完全澀柿單寧細胞的大小和密度較完全甜柿大;柿果實心室間和心室內(nèi)外的單寧細胞密度均不同，且不同類型柿品種之間存在著較大的差異[13]。夏宏義研究發(fā)現(xiàn)，不同柿品種間單寧細胞縱橫徑差異顯著，完全澀柿的單寧細胞縱橫徑較大，中國甜柿和日本完全甜柿均較小，不完全甜柿和不完全澀柿與部分完全澀柿相近[14]。張繼澍等對果實發(fā)育中期的41個柿品種的單寧細胞進行觀察發(fā)現(xiàn)，一般情況下，澀柿單寧細胞的密度大于甜柿，但并不是所有澀柿品種的單寧細胞密度均大于甜柿，有些澀柿品種如作州身不知、巴柿、東洋一等單寧細胞密度較小，而甜柿如水島御所、伊豆、大河御所等密度則較大[15]。同一果實不同部位的單寧細胞大小和密度也不相同，大多數(shù)柿品種果實中部的單寧細胞密度最大，其次是基部，頂部最小;一般從果實頂部到基部，單寧細胞縱徑由小到大，而橫徑變化不明顯。

1.2 單寧細胞的形態(tài)和分布

單寧細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，其在表面特征、褐變程度、形狀、內(nèi)含物的質(zhì)地及質(zhì)壁分離上均表現(xiàn)出多樣性[16]。楊勇根據(jù)單寧細胞不同的分類依據(jù)進行了相應(yīng)描述，如依表面特征分為棘刺狀、瘤狀、凹陷狀及自然平滑狀;依褐變程度分為紅褐變、深褐變、淡褐變、未褐變;依據(jù)幾何形狀分為細長形、長形、橢圓形、近圓形、多角形、尖頭形;依質(zhì)地類型分為碎裂型、易流型、固有型;依質(zhì)壁分離程度分為極分離、稍分離、不分離等[17]。而且單寧細胞主要以單細胞形式存在，幾種不同形狀的單寧細胞可同時存在于同一果實中，有些則以單寧細胞束或細胞團的形式存在。單寧細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)在脫澀過程中也會發(fā)生相應(yīng)變化，陳文軍等研究發(fā)現(xiàn)，正常柿果肉中單寧細胞呈可溶性絮液狀，半脫澀的單寧細胞呈粒漿狀，而完全脫澀的成熟果實中的單寧細胞呈顆粒狀，果實復(fù)澀后單寧細胞又由粒塊狀變成粒塊絮液狀[18]。張寶善等研究表明，不同脫澀方法對柿單寧細胞的影響基本相同，均是使單寧細胞體積縮小，最后變成疏散的小顆粒;返澀后單寧細胞中的單寧溢出，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分散于果肉組織中[10]。

水果的單寧細胞主要存在于果皮中，但不同水果的單寧細胞分布并不完全相同，研究發(fā)現(xiàn)，葡萄[19]、香蕉[20]及石榴[21]等果實的單寧細胞主要分布在外果皮中;而柿果實的單寧細胞主要存在于中果皮內(nèi)，外果皮僅有少量分布，內(nèi)果皮不存在單寧細胞[12]。章志遠等研究發(fā)現(xiàn)，麻竹筍筍體單寧主要分布于薄壁細胞內(nèi)，少量在纖維細胞內(nèi)，維管束中的篩管和導(dǎo)管細胞中無單寧存在[22]。單寧細胞大量存在于樹皮中，史敏晶等對巴西橡膠樹樹皮單寧細胞的研究表明，除伴胞外，次生韌皮部中幾乎所有的薄壁細胞都含有單寧類物質(zhì)，乳管周圍的薄壁細胞中尤易積累單寧，石細胞和周皮中的木栓層以及栓內(nèi)層細胞中也有大量單寧積累，在單寧細胞發(fā)育過程中，單寧首先在細胞質(zhì)中產(chǎn)生，中央大液泡形成后則成為積累單寧的主要場所并最終被單寧類物質(zhì)充滿[23]。吳鈿等研究發(fā)現(xiàn)，5種紅樹科植物葉片的表皮和下皮層的細胞常含有單寧類物質(zhì)[24]。

1.3 單寧細胞的內(nèi)含物及功能

Taira等研究發(fā)現(xiàn)，單寧細胞的內(nèi)含物主要以總酚類物質(zhì)為主，其中單寧類物質(zhì)所占比例最大[25-26]。在柿單寧組分中，主要以縮合單寧為主，占總酚含量的70%～75%，而游離的小分子單寧組分較少[27]。夏宏義等研究表明，成熟柿果肉單位質(zhì)量總酚和縮合單寧含量與單寧細胞總體積占果肉組織的比例呈正相關(guān)關(guān)系，且完全澀柿的總酚含量和縮合單寧含量大于完全甜柿，進一步證明縮合單寧是單寧細胞的主要組分[28-29]?？s合單寧是由黃烷-3-醇類單體聚合而成，單體之間均以C—C鍵相連，分子結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，在水溶液中不易水解[30]。縮合單寧的聚合程度與果實澀味程度有直接聯(lián)系，在一定范圍內(nèi)，果實澀味隨縮合單寧聚合度的增大而增強[31]。

單寧細胞的形成是植物在不利條件下快速作出的防御反應(yīng)，具有保護植物免受生物和非生物危害的防御功能，在抵御惡劣環(huán)境和生物侵害中起重要作用[32]。另外，單寧細胞的內(nèi)含物（單寧）具有保護植物，抗水解、抗腐爛和防止動物危害的作用[33]，還具有結(jié)構(gòu)類型多樣性和生物活性廣譜性[34]等特點，在制革、醫(yī)藥、食品、材料及化工等多學(xué)科領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[35-39]，具有不可估量的開發(fā)利用價值。

1.4 單寧細胞與果肉細胞的區(qū)別

單寧細胞與果肉細胞不論是否染色在形態(tài)上均有所不同，Yang等研究發(fā)現(xiàn)，成熟柿果實的果肉用氯化亞鐵和硫酸亞鐵處理后，單寧細胞呈黑色，果肉細胞無色;用鹽基品紅染色后，單寧細胞呈深紅色，果肉細胞呈淡紅色;結(jié)晶紫染色后，單寧細胞呈深紫色，果肉細胞呈血青色;亮綠可將單寧細胞染成綠色，而果肉細胞呈淡綠色[16]。章志遠等研究發(fā)現(xiàn)，麻竹筍的單寧細胞可被2%氯化亞鐵溶液染成黑色，與不含單寧物質(zhì)的細胞區(qū)別明顯[22]。王慧等研究發(fā)現(xiàn)，翠冠梨的單寧細胞被番紅-固綠染成暗紅色，而果肉細胞被染成淡綠色[40]。楊勇在觀察過程中還發(fā)現(xiàn)，由于單寧細胞與果肉細胞內(nèi)含物不同，折光率也有差異，單寧細胞色深，果肉細胞近于透明[16]。Yonemori等對柿的研究發(fā)現(xiàn)，平核無和宮崎無核2個品種的單寧細胞中含10%～12%的單寧和10%～13%的可溶性糖，而果肉細胞中僅含微量的單寧和20%左右的可溶性糖，二者內(nèi)含物含量差異十分顯著[41]。

2 單寧細胞與果實澀味及果實脫澀的關(guān)系

單寧細胞的結(jié)構(gòu)和密度與果實澀味及果實脫澀關(guān)系密切。Yonemori等對日本完全甜柿、不完全甜柿、完全澀柿及不完全澀柿的4個品種進行觀察發(fā)現(xiàn)，在果實發(fā)育早期，這4個品種的單寧細胞均有細胞壁孔，果實很澀;在果實發(fā)育后期，完全甜柿和不完全甜柿的單寧細胞的細胞壁孔消失，果實脫澀，而完全澀柿和不完全澀柿的單寧細胞結(jié)構(gòu)和澀味變化不明顯;對完全澀柿和不完全澀柿進行乙醇脫澀后發(fā)現(xiàn)，單寧細胞的細胞壁孔閉合，因而認為果實脫澀與單寧細胞的結(jié)構(gòu)有關(guān)[42]。Yonemori等還觀察到，在果實發(fā)育早期，甜柿和澀柿果實的單寧細胞密度大且緊密相連;在果實發(fā)育中后期，甜柿的單寧細胞分離并散布于果肉中，而澀柿則仍緊密相連且分布密集，因而認為單寧細胞的稀釋作用是完全甜柿自然脫澀的主要原因[43-44]。Gottreich研究發(fā)現(xiàn)，未完全成熟的澀柿細胞壁凹陷大而多，細胞壁厚度約減小50%，未完全成熟的甜柿細胞壁凹陷小而少，厚度增加，而當(dāng)果實成熟后，2種類型的柿單寧細胞壁的凹陷程度均有所改變，說明果實澀味與單寧細胞壁的厚度成反比關(guān)系[45]。費學(xué)謙等研究發(fā)現(xiàn)，中國完全甜柿的自然脫澀機理與日本完全甜柿不完全相同，其單寧細胞停止發(fā)育時間晚于日本完全甜柿，且單寧細胞停止發(fā)育時，可溶性單寧繼續(xù)積累[11，46]，由此認為中國完全甜柿的脫澀是由單寧細胞的稀釋和可溶性單寧凝固的雙重作用的結(jié)果。

不同水果單寧細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等不同，其脫澀方式也不同。陳道明研究發(fā)現(xiàn)，不完全澀柿類和完全澀柿類在果實成熟期不能完全自然脫澀，必須經(jīng)過人工脫澀處理才能達到可食用的標(biāo)準(zhǔn)[47]，一般以可溶性單寧含量0.2%作為果實是否脫澀的臨界值[25]。柿果實的人工脫澀方法主要包括CO2脫澀、乙醇脫澀、真空包裝脫澀、溫水脫澀、軟化脫澀及凍融脫澀等[48-49]。石榴汁的脫澀方法為明膠脫澀法，即在100 mL石榴汁中加入12 mL明膠、常溫（10 ℃）下攪拌反應(yīng)40 min、0.45 μm微孔濾膜過濾、100 ℃殺菌30 min，可有效去除石榴汁的澀味[50]。葡萄果實可通過使用植物生長調(diào)節(jié)劑降低澀味，霍珊珊等研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄果實轉(zhuǎn)色期前7 d，用100 mg/L ABA、200 mg/L ABA和400 mg/L GA3噴施果穗均能使果實成熟過程中的單寧含量顯著降低[51]，使果實澀味減弱。不同脫澀方法的脫澀機理也不同，其中CO2、乙醇、真空包裝和溫水脫澀的脫澀機理相同：創(chuàng)造厭氧條件，激活乙醇脫氫酶，產(chǎn)生大量乙醛，然后在乙醛作用下促使單寧細胞內(nèi)的可溶性單寧聚合為不溶性單寧[52-54]，使?jié)断?軟化脫澀與凍融脫澀機理相似，在脫澀過程中單寧細胞受損，釋放出的可溶性單寧與果膠、細胞壁或原生質(zhì)膜的碎片結(jié)合形成不溶性單寧[55-56]，使?jié)断?明膠脫澀機理是單寧與明膠相互作用形成明膠-單寧絡(luò)合物沉淀，使果汁澀味消失[57];植物生長調(diào)節(jié)劑是通過促進與單寧呈競爭關(guān)系的物質(zhì)的合成使單寧合成受阻，從而降低果實澀味[58]。

3 單寧細胞的觀察方法

3.1 組織切片法

組織切片法一般采用光鏡石蠟切片法[10]和電鏡超薄切片法[23]，觀察單寧細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和大小，適用于植物各個部位中單寧細胞的觀察。在研究初期，國內(nèi)外研究者多采用組織切片法[13，59-60]觀察單寧細胞的分布密度，以其分布密度來代表單寧細胞的多少作為單寧細胞研究的一項重要指標(biāo)。切片法具有易觀察、易保存、便于比較等優(yōu)點，但僅適用于發(fā)育前期的果實，因為發(fā)育后期和成熟期果實的單寧細胞排列不規(guī)則，且不在同一平面，切片法易將單寧細胞縱切、橫切、斜切，單寧細胞被切開后，內(nèi)含酚類物質(zhì)外流，影響對單寧細胞的觀察，再者，在制片過程中的一些固定劑和乙醇會對單寧細胞產(chǎn)生影響，引起細胞收縮，因此，采用此法觀察的單寧細胞形態(tài)和數(shù)目無法完全代表單寧細胞的特征，觀察效果降低。

3.2 果肉壓涂法

果肉壓涂法主要應(yīng)用于柿上，其操作步驟較切片法簡便，直接將果肉放于載玻片上，滴加1滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，輕輕敲打蓋玻片，使果肉組織分散均勻，然后在光鏡下觀察測定相關(guān)指標(biāo)[12]。果肉壓涂法能夠清晰地觀察到單寧細胞和果肉細胞的結(jié)構(gòu)，不僅細胞分散度高，并且加入適量水后，單寧細胞可在顯微鏡視野下滾動，能全面看清單寧細胞三維立體的外形特征，并能正確測定其縱橫徑長度，從而能夠克服切片法僅觀察到單寧細胞縱切面或橫切面形狀、對單寧細胞形態(tài)描述不全面的缺點。雖然切片法在觀察果實中單寧細胞所占密度時有一定優(yōu)勢，但在對單寧細胞形態(tài)、大小的描述方面，軟柿果肉壓涂法較切片法具有簡便易行、全面準(zhǔn)確的優(yōu)點。

3.3 果肉過濾澄清法

楊勇采用果肉過濾澄清法，將柿果肉在不銹鋼篩網(wǎng)中壓涂過濾至一個裝清水的容器中，反復(fù)漂洗幾次洗去果肉和雜質(zhì)，即可得到完整潔凈的單寧細胞，然后用吸管吸取單寧細胞置于載玻片上，在光鏡下觀察測定相關(guān)指標(biāo)[17]。該方法能夠清楚地觀察到完整的單寧細胞形態(tài)，準(zhǔn)確測定單寧細胞的縱橫徑長度，但無法準(zhǔn)確測定單寧細胞的密度。

3.4 細胞傾析法

張青林等參考Ikegame等的方法，于柿果的赤道部切取標(biāo)本塊，迅速放入含0.2%單寧酸和2.5%戊二醛的混合溶液中固定12 h，用水沖洗后，又把樣品浸入pH值為10的 0.05 mol/L EDTA的溶液中，在45 ℃、90 r/min的條件下振蕩5 h，單寧細胞經(jīng)過多次傾析與軟組織細胞分離，用滴管吸取1滴單寧細胞放到載玻片上，用萬能熒光顯微鏡觀察。通過IPP5.0統(tǒng)計軟件測定單寧細胞的面積和大小，此方法克服了傳統(tǒng)壓片法和切片法的弊端，可以觀察果實任何時期的單寧細胞，為單寧細胞形態(tài)與生長變化規(guī)律的研究提供了新的思路[61-62]。

4 單寧細胞形成的影響因素

單寧是植物在進化過程中產(chǎn)生的一類次生代謝物質(zhì)，對植物所處的特殊環(huán)境具有自身保護作用，其含量和單寧細胞的形成與植物生長環(huán)境的非生物因素和生物因素密切相關(guān)[63]。

4.1 非生物因素

植物生長的自然環(huán)境對單寧含量和單寧細胞的形成具有重要影響。Kapos等研究發(fā)現(xiàn)，在強酸、貧瘠的土壤條件下，植物體內(nèi)及其枯枝落葉常含有很高的單寧類物質(zhì)[64]。Kubota等研究發(fā)現(xiàn)，土壤干燥度影響桃果實的澀味程度，在桃果實發(fā)育的第3個階段，土壤水分張力在pF2以上則與果實澀味的出現(xiàn)密切相關(guān)[65]。羅美娟等研究發(fā)現(xiàn)，木麻黃小枝單寧含量與離海岸帶的距離呈負相關(guān)關(guān)系，這是因為離海岸帶距離越近，環(huán)境越惡劣，風(fēng)沙危害越嚴(yán)重，木麻黃通過產(chǎn)生更多的單寧類物質(zhì)適應(yīng)更惡劣的環(huán)境[66]。常朝陽等研究發(fā)現(xiàn)，分布于高原荒漠的錦雞兒屬植物較分布于森林和草原的葉片具有更明顯的皮下層，主脈纖維更發(fā)達（5～7層），單寧類物質(zhì)含量更高，表明植物會通過改變自身結(jié)構(gòu)和單寧含量適應(yīng)生態(tài)環(huán)境[67]。

4.2 生物因素

生物刺激對植物單寧含量和單寧細胞的形成也具有較大影響。史敏晶等研究證明，巴西橡膠樹受到機械傷害和植物生長調(diào)節(jié)劑（乙烯利和茉莉酸）刺激時產(chǎn)生大量單寧細胞，其中乙烯利對單寧細胞的誘導(dǎo)效果最顯著[23，68]。曹明蘭對黃瓜的研究也證實，不同濃度的乙烯利浸種處理后的單寧含量較對照均有不同程度的提高[69]。張燕等研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑（水楊酸和乙烯利）處理葡萄果實，其單寧含量均有不同程度的提高[70]。雒珺瑜等研究發(fā)現(xiàn)，棉花對害蟲（綠盲蝽）的抵抗能力與單寧含量呈正相關(guān)關(guān)系[71]。說明機械傷害、植物生長調(diào)節(jié)劑刺激及害蟲侵害等與植物單寧細胞的形成密切相關(guān)。

5 展望

植物單寧細胞的研究越來越受科研領(lǐng)域的關(guān)注。國內(nèi)外學(xué)者通過對植物單寧細胞解剖學(xué)的大量研究闡明了單寧細胞的基本特征及其與果實脫澀的關(guān)系。然而，目前對植物單寧細胞的研究仍存在一些有待解決的問題，應(yīng)加強以下方面的研究：（1）單寧細胞觀察方法方面。目前單寧細胞的觀察方法主要包括切片法、果肉壓涂法、果肉過濾法及傾析法等，其中切片法可以應(yīng)用于植物任何部位單寧細胞的觀察，但其具有易切碎細胞和引起細胞收縮等缺點，影響對單寧細胞完整結(jié)構(gòu)的觀察;而果肉壓涂法、果肉過濾法及傾析法主要針對于果肉，且局限于柿果實單寧細胞的研究上，缺乏對其他植物種類相應(yīng)技術(shù)的研究。因此，有必要開展對其他植物單寧細胞的觀察方法的研究，以期為植物單寧細胞的研究提供進一步的技術(shù)支持。（2）單寧細胞的內(nèi)含物方面。植物單寧細胞的內(nèi)含物主要包括單寧類物質(zhì)，單寧的前期合成包括苯丙烷類代謝途徑和類黃酮代謝途徑，但其后期合成途徑至今尚未研究清楚，應(yīng)利用分子生物學(xué)手段加強對單寧物質(zhì)合成途徑的研究，完善單寧細胞形成機制。（3）單寧細胞與果實澀味關(guān)系方面。單寧細胞的結(jié)構(gòu)、大小、密度及內(nèi)含物含量與果實澀味密切相關(guān)，但目前對果實單寧細胞與果實澀味關(guān)系的研究局限于對柿果實的研究，應(yīng)在此基礎(chǔ)上開展其他水果的研究。（4）開展不同果實脫澀技術(shù)的研究，滿足更廣泛的植物果實降澀需求，提高果實品質(zhì)。

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