丹參素體外促進胚胎干細胞向心肌分化作用研究

王聿杰

遼寧省軍區(qū)沈陽第八離職干部休養(yǎng)所門診部，遼寧沈陽110016

中國傳統(tǒng)中藥丹參為唇形科植物丹參的根。丹參的中成藥制劑在我國已通過國家審批并在臨床應(yīng)用多年，用于心肌缺血和冠狀動脈心臟病的治療。丹參素是丹參的活性成分之一，對心血管疾病具有治療作用。丹參素能抵抗氧化應(yīng)激對心肌細胞的損傷，減少心肌缺血時心肌細胞凋亡，具有保護心臟的作用[1-4]。同時，丹參素對于動脈粥樣硬化也具有保護作用[5]。胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)分離于早期胚胎的內(nèi)細胞團，具有永生性和多向分化潛能。Klug等[6]通過ESCs形成擬胚體(embryoid bodies，EBs)體外誘導(dǎo)ESCs分化成為心肌細胞。Kehat等[7]建立可重復(fù)的ESCs體外自發(fā)向心肌分化模型。本研究利用小鼠ESCs體外向心肌分化模型，分別加入丹參及丹參素，探討其促心肌細胞分化的作用，進而闡述丹參素在缺血性心肌病中發(fā)揮心臟保護作用的機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 小鼠ESCs購自ATCC。主要試劑包括DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、IMDM培養(yǎng)基(GIBCO)，LIF(CHEMICOH)，丹參注射液(國藥集團宜賓制藥)，丹參素(MACKLIN，R832661-100 mg)，western及IP細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime)，α-肌球蛋白重鏈(α-myosin heavy chain，α-MHC)、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 4(octamer-binding transcription factor 4，OCT4)及GAPDH(ABCAM)，辣根過氧化物酶羊抗兔二抗(Transgene)。

1.2 研究方法

1.2.1 ESCs培養(yǎng)與擴增 含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，加入 LIF，終濃度100 U/ml，保持ESCs的未分化狀態(tài)，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)小鼠ESCs，隔日換液，待細胞集落80% ～90%融合時傳代。

1.2.2 EBs制備 以含20%胎牛血清的IMDM為分化培養(yǎng)基，將ESCs制成濃度為5×104個/ml的細胞懸液，以每滴20 μl種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿蓋上，培養(yǎng)皿內(nèi)中放入10 ml PBS，蓋上皿蓋，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)48 h后，ESCs形成大小均一的EBs。從懸滴中吸出形成EBs，轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中，每孔接種1個EB，并加入100 μl分化培養(yǎng)基，96孔板于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 分組及心肌誘導(dǎo)分化 EBs接種4 d，僅加入分化培養(yǎng)基的EBs為自然分化組，向培養(yǎng)基中加入丹參注射液(10 mg/ml)、丹參素(20 μg/ml)的EBs分別為丹參誘導(dǎo)分化組、丹參素誘導(dǎo)分化組。于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo) 于EBs接種第12天，于顯微鏡下觀察各組EBs的生長及節(jié)律性收縮的合胞體出現(xiàn)情況，以出現(xiàn)節(jié)律性收縮的心肌合胞體為EBs心肌分化陽性。記錄各組陽性EBs計數(shù)，并計算心肌分化率。接種第12天檢測干細胞標(biāo)志蛋白OCT4與心肌細胞標(biāo)志蛋白α-MHC的表達。將EBs刮下，提取EBs總蛋白并進行蛋白定量，操作參照western、IP細胞裂解液及BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)印70 V、2 h將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉非特異性蛋白2 h，1：500稀釋兔抗鼠 OCT4、α-MHC、GAPDH，4℃孵育過夜，1：5 000 稀釋羊抗兔二抗，37℃孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光成像。

心肌分化率 ＝陽性 EBs計數(shù)/EBs總數(shù) ×100%

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以例(百分率)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài) EBs接種后4 d，可觀察到EBs周邊部出現(xiàn)自發(fā)的節(jié)律性收縮細胞的合胞體。接種后4～12 d，EBs的不同部位可觀察到1個或多個有自發(fā)節(jié)律收縮的合胞體，且形態(tài)、收縮節(jié)律不相同，見圖1。

圖1 EBs接種后細胞形態(tài)(200倍)

2.2 各組心肌細胞分化率 接種后第12天心肌細胞分化率，自然分化組為55.4%，丹參誘導(dǎo)分化組為78.4%，丹參素誘導(dǎo)分化組為70.7%。丹參誘導(dǎo)分化組、丹參素誘導(dǎo)分化組的心肌細胞分化率均顯著高于自然分化組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 分化后標(biāo)志蛋白表達水平比較 分化培養(yǎng)第12天，丹參誘導(dǎo)分化組、丹參素誘導(dǎo)分化組干細胞標(biāo)志蛋白OCT4表達水平明顯低于自發(fā)分化組，心肌細胞標(biāo)志蛋白α-MHC表達水平明顯高于自發(fā)分化組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 分化后標(biāo)志蛋白表達水平

3 討論

丹參在治療心血管疾病中具有重要價值，在心肌梗死時，丹參表現(xiàn)出顯著的心肌保護作用[8-10]。丹參對心臟保護作用是多種活性成分的協(xié)同作用[11]。丹參的化學(xué)成分分為脂溶性的丹參酮類化合物和水溶性的酚酸類化合物。丹參素屬于水溶性成分之一。有研究表明，丹參、丹參素能促進胎盤間充質(zhì)干細胞的心肌細胞分化[12]。

本研究中，ESCs在向心肌細胞分化過程中融合形成合胞體，且合胞體具有自發(fā)的節(jié)律性收縮；EBs的不同位置可形成多個自發(fā)收縮的合胞體，且每個合胞體的收縮節(jié)律不同。說明ESCs分化成為具有收縮性的心肌工作細胞(心房肌、心室肌)和具有不同節(jié)律的自律細胞(竇房結(jié)、房室結(jié)、浦肯野氏細胞)。丹參誘導(dǎo)分化組、丹參素誘導(dǎo)分化組中觀察到的合胞體同樣表現(xiàn)出不同的收縮節(jié)律，說明丹參、丹參素提高干細胞向心肌細胞方向的分化效率，但未影響干細胞定向分化為某種心肌細胞。本研究結(jié)果顯示，丹參誘導(dǎo)分化組、丹參素誘導(dǎo)分化組的心肌分化率高于自發(fā)分化組，說明丹參與丹參素均具有促進心肌分化的作用。而且丹參的促心肌分化作用強于丹參素，說明除丹參素外，丹參中還有其他成分具有促進干細胞向心肌分化作用。

ESCs在向心肌細胞分化過程中，干細胞標(biāo)志蛋白如OCT4等表達下調(diào)，而心肌細胞標(biāo)志蛋白如α-MHC等表達上調(diào)[13-15]。干細胞蛋白的下調(diào)水平與心肌細胞蛋白的上調(diào)水平反映心肌細胞分化率。本研究結(jié)果顯示，丹參誘導(dǎo)分化組、丹參素誘導(dǎo)分化組干細胞標(biāo)志蛋白OCT4表達水平明顯低于自發(fā)分化組，心肌細胞標(biāo)志蛋白α-MHC表達水平明顯高于自發(fā)分化組，說明丹參、丹參素具有促進ESCs向心肌細胞分化的作用。

綜上所述，丹參具有促心肌分化作用，丹參素是其促心肌分化的活性成分之一。除丹參素外，丹參中應(yīng)有其他具有促進干細胞向心肌分化的成分。丹參治療心肌缺血性疾病作用的機制包括促進干細胞向心肌細胞分化作用。