葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中的表達及發(fā)酵條件優(yōu)化

郭亞蘭，周雨朦，吳 斌，何冰芳

(1.南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211800; 2.南京正大天晴制藥有限公司，江蘇南京222062；3.南京工業(yè)大學藥學院，江蘇南京211800)

木聚糖是除纖維素外含量最豐富的植物細胞壁多糖[1]。自然界中，絕大多數(shù)木聚糖結(jié)構復雜且具有高度分枝。因此，木聚糖的完全降解是一個復雜的過程，需要各種酶協(xié)同作用，包括β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶、D-葡萄糖醛酸酶和L-阿拉伯呋喃糖苷酶等[2]。其中，β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶，通常定義為木聚糖酶，是木聚糖降解酶系中最關鍵的酶。它能作用于木聚糖分子的主鏈骨架，將木聚糖水解為低聚木糖以及少量的木糖和阿拉伯糖[3]。

迄今為止，大多數(shù)的木聚糖酶屬于糖苷水解酶10家族(GH10)和11家族(GH11)[4]。然而，這些酶的活性受木聚糖取代基的數(shù)量和密度的影響。高取代的側(cè)鏈，如甲基葡萄糖醛酸(MeGA)和乙?；龋茐牧薌H10和GH11家族的木聚糖酶對主鏈的可及性，降低了酶水解木聚糖的能力。來自GH30家族的木聚糖酶能特異性地降解富含D-葡萄糖醛酸(GlcA)和甲基葡萄糖醛酸等側(cè)鏈殘基的木聚糖[5]，在硬木木聚糖等高側(cè)鏈取代的木聚糖降解中起到重要的補充作用。目前研究者已在歐文氏菌(Erwiniachrysanthe)[6]、熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)[7]及類芽孢桿菌(Paenibacillusbarcinonensis)[8]等菌株中純化獲得了GH30的木聚糖酶。此外，許多GH10和GH11的木聚糖酶已在大腸桿菌[9]、枯草芽孢桿菌[10]和巴斯德畢赤酵母[11]中異源表達。枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)具有諸多優(yōu)點，如非致病性、增加蛋白質(zhì)可溶性表達、重組表達蛋白的內(nèi)毒素低、更好的生物活性以及胞外分泌表達等[12-13]。然而目前還未見有GH30家族木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中表達的研究報道。

筆者所在課題組在前期研究中從枯草芽孢桿菌LC-9中篩選到一個葡萄糖醛酸木聚糖酶。本文中，筆者克隆葡萄糖醛酸木聚糖酶基因，并利用大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pMA05在枯草芽孢桿菌WB800中進行該酶的異源表達，優(yōu)化其表達條件，以期為該酶的應用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

枯草芽孢桿菌BacillussubtilisLC-9、大腸桿菌E.coliDH5α、枯草芽孢桿菌BacillussubtilisWB800以及大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pMA05保存于何冰芳教授實驗室。

1.1.2 主要試劑

各種限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA maker、標準蛋白，TaKaRa公司；溶菌酶、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，Axygen公司；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂糖，Oxoid公司；Beechwood木聚糖、NaCl、Tris-base，市售分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基[14](g/L)：蛋白胨 10.0、NaCl 10.0、酵母粉5.0；固體培養(yǎng)基中另加瓊脂20.0。

抗生素培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基滅菌后冷卻至60 ℃再加入過濾除菌的氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)使其終質(zhì)量濃度分別為100 或50 mg/L。

1.2 大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的DNA操作

質(zhì)粒提取、DNA酶切、電泳、轉(zhuǎn)化等DNA操作參照文獻[14]進行。

1.3 葡萄糖醛酸木聚糖基因的克隆

根據(jù)實驗室前期所得序列設計PCR引物，其基因帶有自身信號肽。上下游引物的5′端分別設計了BamHⅠ、NdeⅠ酶切位點。上游引物BsXyn30-F：5′-A￣A￣A￣A￣G￣G￣A￣G￣C￣G￣A￣T￣T￣T￣A￣C￣A￣T￣A￣T￣G￣A￣T￣T￣C￣C￣A￣C￣G￣C￣A￣T￣A￣A￣A￣A￣A￣A￣A-3′，下游引物BsXyn30-R：5′-G￣A￣G￣C￣T￣C￣G￣A￣C￣T￣C￣T￣A￣G￣A￣G￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣T￣A￣A￣C￣G￣A￣T￣T￣T￣A￣C￣A￣A￣C￣A￣A￣A￣T￣G￣T￣T￣G￣T-3′。

以枯草芽孢桿菌LC-9為DNA模板，進行PCR擴增。PCR的反應體系為50 μL。其中，模板2 μL、上下游引物各2 μL、2×Priemix 25 μL、重蒸水19 μL。

反應條件：95 ℃預變形5 min后，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，進行32個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA快速膠回收待用。

1.4 表達載體的構建

將pMA05質(zhì)粒用BamHⅠ、NdeⅠ進行雙酶切，得到線性質(zhì)粒與葡萄糖醛酸木聚糖酶基因，進行同源臂重組連接，之后轉(zhuǎn)入E.coliDH5α，菌落PCR驗證陽性克隆子。

1.5 葡萄糖醛酸木聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)及表達

將質(zhì)粒pMA05-BsXyn30轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB800，得到重組菌WB800/pMA05-BsXyn30，加入含卡那霉素的LB種子培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)12 h。以2%(體積分數(shù))的接種量接入LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)36 h，室溫下8 000 r/min離心20 min后收集上清。

1.6 表達產(chǎn)物的分析鑒定

利用SDS-PAGE對收集的胞外上清液進行表達產(chǎn)物的分析，采用二硝基水楊酸(DNS)法[15]測葡萄糖醛酸木聚糖酶的酶活。取稀釋好的酶液0.5 mL加入到孵育好的1 mL 10 g/L的木聚糖中，在55 ℃下反應10 min后立即加入3 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻后在540 nm的波長下用分光光度計測相應吸光值。

葡萄糖醛酸木聚糖酶酶活定義：每分鐘生成1 μmol還原糖所需酶量定義為1個酶活單位(U)。

1.7 發(fā)酵條件優(yōu)化

1)培養(yǎng)時間對菌株生長及產(chǎn)酶的影響。挑取單菌落，接入含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，以2%的接種量接入液體LB培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，在37 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)。分別在3、6、9、12、24、36、48、60、72和84 h取樣，測定菌液OD600以及發(fā)酵上清液中的木聚糖酶酶活。

2)培養(yǎng)溫度對菌株生長及產(chǎn)酶的影響。將重組菌株接種于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h(37 ℃、180 r/min)作為種子液，以2%接種量接種后分別于25、30、37和45 ℃中振蕩培養(yǎng)36 h后，對菌體的生長和產(chǎn)酶分別進行檢測。

3)培養(yǎng)基起始pH對菌株生長及產(chǎn)酶的影響。菌株經(jīng)種子液培養(yǎng)，以2%接種量接種分別于初始pH為6.5、7.0、7.5和8.0的LB基礎培養(yǎng)基中，36 h后對菌體的生長和產(chǎn)酶分別進行檢測。

1.8 培養(yǎng)基碳源優(yōu)化

1)碳源對菌株生長及產(chǎn)酶的影響。菌株經(jīng)種子液培養(yǎng)，以2%接種量接種于LB培養(yǎng)基中，分別添加1%的麥芽糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇，36 h后檢測菌株的生長和產(chǎn)酶情況。

2)碳源濃度對菌株生長及產(chǎn)酶的影響。以2%接種量接種于LB培養(yǎng)基中，分別添加5、10、15、20、25和30 g/L的山梨醇，36 h后檢測菌株的生長和產(chǎn)酶情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖醛酸木聚糖酶基因克隆

從枯草芽孢桿菌LC-9中提取基因組總DNA，以此為模板，通過PCR擴增得到編碼葡萄糖醛酸木聚糖酶的基因，并進行分析，結(jié)果見圖1。由圖1可知，克隆條帶大小與理論基因的長度一致，說明成功從模板中擴增出該片段。將擴增得到的片段與pMD18-T vector連接，導入大腸桿菌中并送至測序公司測序。

圖1 葡萄糖醛酸木聚糖酶基因的PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification product of glucurono-xylanase gene

葡萄糖醛酸木聚糖酶的基因為1 266 bp，編碼 422個氨基酸，基因的開放閱讀框(ORF)含有信號肽及成熟肽序列。其中，成熟肽的基因序列為1 170 bp，編碼389個氨基酸(BsXyn30)。

BsXyn30與其他GH30家族木聚糖酶的多序列進行比對，結(jié)果見圖2。由圖2可知：BsXyn30與來自枯草芽孢桿菌168的XynC有99%的同源性[16]，與來自Bacillussp.strain BP-7的Xyn5B同源性為93%[17]，與來自P.barcinonensis的Xyn30D同源性為79%[8]。

2.2 重組工程菌的構建結(jié)果

2.2.1 質(zhì)粒的構建結(jié)果

雙酶切質(zhì)粒并與木聚糖酶基因片段進行同源臂重組連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中得到重組質(zhì)粒，經(jīng)菌落PCR驗證，結(jié)果見圖3。由圖3可知，PCR擴增出來的片段與目的基因大小一致，表明重組質(zhì)粒成功插入了大小約為1 200 bp的木聚糖酶基因片段。

圖2 序列比對結(jié)果Fig.2 Amino acid sequence alignment of BsXyn30 from B.subtilis LC9,XynC from Bacillus subtilis 168,Xyn5B from Bacillus sp.strain BP-7,Xyn30D from Paenibacillus barcinonensis

圖3 菌落PCR驗證Fig.3 Verification of colony PCR

圖4 重組酶的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the recombinantglucurono-xylanase

2.2.2 葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中的表達

將重組質(zhì)粒化轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB800，37 ℃發(fā)酵36 h后離心得到胞外上清液，進行酶活檢測以及SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知：木聚糖酶自身信號肽在枯草芽孢桿菌中可以正常發(fā)揮作用，其表達產(chǎn)物能有效分泌到胞外，通過DNS法[15]檢測胞外上清液的木聚糖酶活力可達14 U/mL，其表觀分子量為4.3×104。

2.3 葡萄糖醛酸木聚糖酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

圖5為重組菌株的生長及產(chǎn)酶曲線。從圖5可以看出，在最開始的3 h細菌生長緩慢，之后生長速度加快進入對數(shù)期并在24 h達到生長的最高峰，之后進入衰亡期。前期培養(yǎng)基中營養(yǎng)豐富，細胞處于生長狀態(tài)，在后期發(fā)酵液中營養(yǎng)匱乏以及細菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物使細菌生長受到抑制甚至死亡，造成總生物質(zhì)大幅下降。

在葡萄糖醛酸木聚糖酶BsXyn30的產(chǎn)酶時間上，在對數(shù)前期酶活增長緩慢。到對數(shù)期后期以及穩(wěn)定期前期酶活增長迅速，并在36 h時達到最高，之后緩慢下降。因為在穩(wěn)定期前期，細菌生長速度開始下降，但細菌內(nèi)部的質(zhì)粒拷貝數(shù)仍然在迅速增長。在36 h菌液酶活達到最高值，為13.2 U/mL，而后酶活開始下降。接下來以此酶活為對照(100%)，進行發(fā)酵條件優(yōu)化。

圖5 重組菌的生長與產(chǎn)酶曲線Fig.5 Growth curves and enzyme production ofrecombinant strain

2.3.2 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

考察溫度對重組菌株的產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知：重組菌最佳生長溫度在37 ℃，并且在37 ℃具有最高的葡萄糖醛酸木聚糖酶酶活。當溫度達到45 ℃，菌體量明顯下降導致酶活力降低，而且重組菌的最適生產(chǎn)溫度與大多數(shù)枯草芽孢桿菌的生長溫度一致[18-19]。

圖6 溫度對重組菌產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of temperatures on enzymeproduction of recombinant strain

2.3.3 培養(yǎng)基起始pH對產(chǎn)酶的影響

考察pH對重組菌株的產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知：在pH 6.5～8.0的范圍內(nèi)，重組菌都能生長良好，在pH為7.5時重組菌生長得最好，酶活也最高，達到13.8 U/mL?？傮w來看，培養(yǎng)基起始pH在7.0～8.0的范圍內(nèi)，葡萄糖醛酸木聚糖酶的表達都較好，而且酶活變化與菌體生長狀態(tài)一致，正常的培養(yǎng)基初始pH在7.4左右，故不需要調(diào)節(jié)pH。

圖7 初始 pH 對重組菌產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of medium initial pH on enzymeproduction of recombinant strain

2.4 培養(yǎng)基碳源優(yōu)化

碳源是微生物生長及產(chǎn)酶過程中非常重要的影響因子?？疾觳煌荚磳χ亟M菌生長及產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知：碳源對重組菌的生長和產(chǎn)酶有重要影響，山梨醇作為碳源可以被重組菌很好地利用，酶活和菌體量都達到最大。其他碳源也可以被菌很好的利用，但相比而言，以山梨醇作為碳源時，菌體量最大，相對酶活也最高，為56.2 U/mL，約為普通LB培養(yǎng)下的3倍。而且周煌凱等[18]在研究木聚糖酶XynA在枯草芽孢桿菌中表達時發(fā)現(xiàn)，山梨醇是重組菌B.subtilisGJ148-XynA生長和產(chǎn)酶的最佳碳源。

圖8 碳源對重組菌產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effects of carbon sources on enzymeproduction of recombinant strain

2.5 培養(yǎng)基碳源濃度的優(yōu)化

碳源對菌株產(chǎn)酶及生長的影響非常大。因此，筆者進一步優(yōu)化碳源濃度對菌株產(chǎn)酶及生長的影響，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知：在5～20 g/L的碳源條件下，菌株的生長及產(chǎn)酶隨著碳源濃度的增加而增加，并在20 g/L時酶活及OD達到最高，酶活最高為76.0 U/mL，為優(yōu)化前產(chǎn)酶的5.4倍。

圖9 碳源濃度對重組菌產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effects of carbon sources concentration onenzyme production of recombinant strain

當碳源濃度過高時，菌株生長及產(chǎn)酶反而會下降。重組菌生長及產(chǎn)酶的最適碳源為20 g/L。在枯草芽孢桿菌中表達淀粉酶的研究發(fā)現(xiàn)，最適碳源為淀粉，添加量為20 g/L[20]。

3 結(jié)論

成功克隆了葡萄糖醛酸木聚糖酶基因，并構建了重組質(zhì)粒，在枯草芽孢桿菌WB800實現(xiàn)了其高效表達。通過對重組菌的碳源及發(fā)酵條件優(yōu)化，在37 ℃下重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶，酶活最高可達76.0 U/mL，約為優(yōu)化前產(chǎn)酶的5.4倍，表明達到了高效分泌表達。為今后葡萄糖醛酸木聚糖酶BsXyn30在食品、造紙以及飼料工業(yè)上的應用奠定了基礎。