HILIC-MS/MS技術同時檢測蛹蟲草中蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷含量的方法學

張銘雅，朱志銘，姚 迪，陳俏慧，鮑曉文，陳嘉偉，朱健偉，馬 博

(南京工業(yè)大學藥學院，江蘇南京211800)

蛹蟲草(C.militariseL.Fr Link)，又稱北冬蟲夏草、北蟲草，是我國名貴中藥材之一。近年來許多學者對蛹蟲草做了深入而細致的研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤[1-2]、抗氧化[3]、抗炎[4]、免疫抑制[5]及降血糖[6]等多重功效。Xiao等[7]研究表明蛹蟲草中含有核苷類化合物、蟲草酸、蟲草多糖和豐富的人體必需的氨基酸、微量元素等多種生物活性物質，其中，核苷類成分主要包括蟲草素、腺苷和肌苷等。而蟲草素是一種具有天然生物活性的核苷類抗生素,其具有的抗氧化作用可以有效逆轉酒精性肝損傷[8]。Yong等[9]研究發(fā)現(xiàn)蟲草素可以通過下調尿酸轉運體1(uric acid transporter 1，URAT1)逆轉小鼠的高尿酸血癥，同時所具有的抗腫瘤活性，已經被用于白血病等惡性腫瘤的輔助治療[10]。腺苷一直以來被用于檢測和衡量蛹蟲草的質量標準。肌苷是食品和醫(yī)藥產品的重要中間體和活性成分。蟲草酸則具有清除自由基、擴張血管和降低血壓的作用[11]。

蛹蟲草類功能食品的活性成分分析，對其相關產品的質量監(jiān)督控制和活性物質的功效研究具有極為重要的意義。目前，已報道的蛹蟲草功效成分的檢測技術主要有高效液相色譜法(HPLC)和PCR方法[12-13]。但是蛹蟲草成分比較復雜，背景干擾較大，且有效成分結構相似，具有較高的水溶性，普通的反相色譜柱很難達到基線分離。Yang等[14]采用離子對反相液相色譜-質譜聯(lián)用(IP-RP-LC-MS)有效地定量測定了蛹蟲草中的核酸類化合物，但并未同時檢測蟲草酸的含量。

親水作用色譜(hydrophilic interaction c￣h￣r￣o￣m￣a￣t￣o￣g￣r￣a￣p￣h￣y)是近年來迅速發(fā)展起來的一種分離強極性及親水性化合物的色譜模式[15]。在此基礎上，筆者建立了一種親水作用色譜法-串聯(lián)質譜分析蟲草類物質蛹蟲草中蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷的定量方法，并對其方法學進行考證，以期為蛹蟲草類相關產品質量控制、篩選高活性蛹蟲草及進一步研究蛹蟲草的功效提供技術基礎和相關參考。

圖1 蛹蟲草及成分結構式Fig.1 Cordyceps militaris and structures

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蟲草素標準品(純度98%)、蟲草酸標準品(純度98%)，德國Fluke公司；腺苷標準品(純度98%)、肌苷標準品(純度98%)，美國Sigma公司；對乙酰氨基酚(IS，批號：100018-200408)，中國藥品生物制品檢定所；甲酸(色譜純)，美國Fluka公司；甲醇、乙腈(色譜純)，德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

AB Sciex 4000 Q TRAP型質譜儀，美國AB Sciex公司； LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司：包括2個LC-20AD型泵、SIL-20AC型自動進樣器、CTO-20AC型柱溫箱、CBM-20A型控制器； BT125D型電子天平，德國Sartorius公司； BT224S型電子天平，德國Sartorius公司； 5810R型冷凍離心機，德國Eppendorf公司； SPD2010型真空濃縮裝置，美國Thermo公司； Milli-Qintegral 3型超純水機，美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

流動相：乙腈-0.05 %甲酸緩沖鹽溶液(體積比為85∶ 15)；流速：0.2 mL/min；色譜柱：Ultimate Hilic Silica 2.1 mm×150 mm,5 μm；柱溫：40 ℃。

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子源(turbo Spray)；多級反應監(jiān)測(MRM)；正離子模式；霧化溫度(TEM)：500 ℃；輔助氣體(GS2)：344.75 kPa；霧化氣體(GS1)：344.75 kPa；氣簾氣體(Curtain Gas)：68.95 kPa；射出電壓(CXP)：10 V；離子噴霧電壓(IS)：4 500 V。蟲草素、蟲草酸、腺苷、肌苷的質譜條件見表1。

表1 各物質的質譜條件

1.3.3 工作液和內標溶液的制備

1)內標溶液的制備 精密稱取對乙酰氨基酚標準品于10 mL量瓶中，乙腈溶解定容，配制成質量濃度為0.3 mg/mL的貯備液，置于4 ℃冰箱保存待用。取適量乙酰氨基酚貯備液，加乙腈溶解并定量稀釋制成100 μg/mL的工作液。

2)蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷對照品儲備液的制備 精密稱取蟲草素，蟲草酸，腺苷和肌苷標準品于10 mL量瓶中，乙腈溶解定容，配成質量濃度為0.5 mg/mL的貯備液，置于4 ℃冰箱保存。取適量蟲草素貯備液，加乙腈溶解并定量稀釋制成質量濃度分別為0.2、0.5、1、2、5、10、20和50 μg/mL的工作液；取適量蟲草酸貯備液，加乙腈溶解并定量稀釋制成質量濃度分別為2、5、10、20、50、100、200和500 μg/mL的工作液；取適量腺苷貯備液，加乙腈溶解并定量稀釋制成質量濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2和5 μg/mL的工作液；取適量肌苷貯備液，加乙腈溶解并定量稀釋制成質量濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2和5 μg/mL的工作液；置4 ℃冰箱保存，備用。

1.3.4 標準曲線及定量下限的測定

分別精密吸取蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷對照品溶液加入乙腈中，配制成含蟲草素的質量濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2和5 μg/mL的含藥溶液；配制成含蟲草酸的質量濃度分別為0.2、0.5、1、2、5、10、20和50 μg/mL 的含藥溶液；配成含腺苷的質量濃度分別為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 μg/mL的含藥溶液；配制成含肌苷的質量濃度分別為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 μg/mL的含藥溶液；進樣并記錄色譜圖。計算待測物峰面積As和內標峰面積Ai的比值(=As/Ai)。以峰面積比值對質量濃度(q)進行回歸計算，得回歸方程及線性趨勢圖。

1.3.5 精密度與準確度的測定

分別精密吸取蟲草素、蟲草酸、腺苷及肌苷對照品溶液加入乙腈中，配制成含蟲草素的質量濃度分別為0.04、0.25和4 μg/mL的含藥溶液；配制成含蟲草酸的質量濃度分別為0.4、2.5和40 μg/mL的含藥溶液；配制成含腺苷的質量濃度分別為0.004、0.025和0.4 μg/mL的含藥溶液；配制成含肌苷的質量濃度分別為0.004、0.025和0.4 μg/mL的含藥溶液作為質控樣品(n=6)，進樣后計算精密度和準確度。

1.3.6 穩(wěn)定性考察

配制蟲草素低、中、高質量濃度(0.04，0.25和4 μg/mL)；蟲草酸低、中、高質量濃度(0.4，2.5和40 μg/mL)；腺苷低、中、高質量濃度(0.004，0.025和0.4 μg/mL)；肌苷低、中、高質量濃度(0.004，0.025和0.4 μg/mL)的含藥溶液分別置于室溫、4 ℃保存24 h，進樣后計算精密度和準確度。

2 結果與討論

2.1 特異性考察結果

對蛹蟲草中4個主要成分(蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷)進行HILIC-MS/MS檢測。首先通過串聯(lián)質譜確定化合物的母離子和子離子色譜圖(圖2～5)，采用MRM模式確定離子對。本試驗采用HILIC色譜柱，等度洗脫。蛹蟲草中蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷的掃描圖及二級質譜圖，見圖2～5，保留時間見圖7～8。

圖4 腺苷離子對質譜Fig.4 Ion pair map-adenosine

由圖2～5可知:蟲草素的分子離子峰位于252.3；蟲草酸的分子離子峰位于183.1；腺苷的分子離子峰位于268.2；肌苷的分子離子峰位于269.2。圖6為空白生物樣品色譜圖，由圖6可知：內源性本底含量較低，內標中所含雜質不干擾待測藥物的分析。

圖5 肌苷離子對質譜Fig.5 Ion pair map-inosine

圖6為定量下限色譜圖，樣品在較低濃度下仍具有較好的靈敏度。由圖6可知：內標保留時間在2.49 min左右；蟲草酸的保留時間在4.27 min左右；蟲草素的保留時間在3.21 min左右；腺苷的保留時間在3.52 min左右；肌苷的保留時間在3.49 min左右。圖7為空白生物樣品加內標物質及待測物質色譜圖。色譜圖所示待測物和內標峰形良好，無雜峰干擾測定，說明本方法具有較高的特異性。

圖6 LLOQ色譜Fig.6 LLOQ chromatogram

圖7 樣品色譜Fig.7 Sample chromatogram

2.2 標準曲線及定量下限的測定結果

按1.3.4節(jié)樣品處理方法項操作，分別以蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷各自的峰面積與IS峰面積的比值(Y),對質量濃度(X)進行直線回歸(權重1/X2)，得到蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷回歸方程及定量下限(lower limit of quantification，LLOQ)，蟲草素為Y=0.002X+0.020(R2=0.995 3)，LLOQ為0.02 μg/mL；蟲草酸為Y=0.195 3X-0.002 9(R2=0.999 4)，LLOQ為0.2 μg/mL；腺苷為Y=0.020 4X+0.002 9(R2=0.997 0)，LLOQ為0.002 μg/mL；肌苷為Y=0.018X+0.003 3(R2=0.995 0)， LLOQ為0.002 μg/mL。由此可知：蟲草素在0.02～5 μg/mL濃度范圍內線性關系良好，LLOQ為0.02 μg/mL；蟲草酸在0.2～50 μg/mL濃度范圍內線性關系良好，LLOQ為0.2 μg/mL；腺苷在0.002～0.5 μg/mL濃度范圍內線性關系良好，LLOQ為0.002 μg/mL；肌苷在0.002～0.5 μg/mL濃度范圍內線性關系良好，LLOQ為0.002 μg/mL。

2.3 精密度與準確度的測定結果

將測得的蟲草素、蟲草酸、腺苷以及肌苷峰面積與內標的峰面積比值代入當天的標準曲線計算各批測得質量濃度，經方差分析求得本法的精密度，并與制備濃度比較求得方法的準確度(表2)。

表2 HILIC-MS/MS法測定蟲草素、蟲草酸、腺苷以及肌苷的精密度與準確度(n=6)

由表2可以看出：蟲草素日內精密度范圍在2.33%～4.45%，日間范圍4.87%～8.11%，準確度為-2.5%～1.2%。蟲草酸日內范圍在5.11%～9.72%，日間范圍5.43%～8.20%，準確度為-7.1%～3.4%。腺苷日內范圍在3.52%～6.23%，日間范圍4.98%～9.32%，準確度為-3.1%～4.2%。肌苷日內范圍在4.18%～7.29%，日間范圍5.29%～9.30%，準確度為0.9%～1.8%。以上結果表明：樣品的低、中和高濃度的精密度、準確度均在±10.0%內，符合分析檢測的要求。

2.4 樣品穩(wěn)定性考察結果

各儲存條件或處理條件下蟲草素、蟲草酸、腺苷以及肌苷的穩(wěn)定性見表3。由表3可知:低、中和高3

表3 各儲存條件或處理條件下蟲草素、蟲草酸、腺苷以及肌苷的穩(wěn)定性(n=6)

個質量濃度的蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷在4 ℃及室溫環(huán)境下的穩(wěn)定性分別為-4.9%～5.5%、-2.1%～2.8%、-1.3%～6.2%和-3.7%～6.6%，證明在室溫放置24 h和自動進樣盤中4 ℃放置24 h后樣品均未發(fā)生降解。

3 結論

1)建立了一種快速高效液相色譜-質譜聯(lián)用同時檢測蛹蟲草中蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷的含量的分析方法。蟲草素、蟲草酸、腺苷以及肌苷的色譜圖顯示其峰形良好，無雜峰干擾；4種化合物的標準曲線的線性關系良好，可滿足實際樣品檢測靈敏度的要求。蟲草素、蟲草酸、腺苷以及肌苷的精密度均小于10.0%，準確度在8.0%左右。4種化合物在室溫放置24 h和自動進樣盤中4 ℃放置24 h均未發(fā)生降解。綜上所述，本方法具有較好的特異性、靈敏度和重現(xiàn)性，可用于蛹蟲草及相關保健品的檢測。

2)首次采用以HILIC與MS/MS相結合的形式，建立了同時檢測蛹蟲草中蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷含量的分析方法，整個色譜的運行時間約8 min，相比于普通HPLC的分離方法，大大提高了分析效率，分離效率高，且腺苷、肌苷的靈敏度可以達到0.004 μg/mL，可以用于蛹蟲草等相關產品的微量檢測。

3)HILIC-MS/MS的方法中，采用了串聯(lián)質譜中MRM的檢測模式，其特點在于檢測限低，能夠檢測到蛹蟲草中的痕量物質；且專屬性高，可以完成多個化合物，尤其是結構類似化合物的同時檢測，且特異性高，靈敏度高，能有效提高分析效率。

4)本方法不僅可用于蛹蟲草活性成分的定量分析，同時也為區(qū)別天然蟲草與人工蛹蟲草提供了實驗參考。對于含有蛹蟲草成分的保健品等相關產品，對其有效成分腺苷和蟲草素也能進行準確地定性定量分析，為相關產品的質量控制、篩選高活性蛹蟲草及進一步研究蛹蟲草的功效提供了技術基礎和參考。