機(jī)械輔助酶水解法制備竹基纖維素微粒的研究

王 妍，張?jiān)潞椋Z潤(rùn)紅

（1.江蘇海洋大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 連云港222005；2.連云港師范高等專(zhuān)科學(xué)校初等教育學(xué)院，江蘇連云港222006）

竹子是世界上生長(zhǎng)最快的植物之一，與木材相比，具有強(qiáng)度高、韌性好、硬度大等優(yōu)點(diǎn)［1］，可以用來(lái)制備高質(zhì)量的纖維素材料。中國(guó)竹資源豐富，約占全世界竹林總面積的1/4［2］。在中國(guó)，竹子的使用歷史悠久，竹纖維被廣泛地應(yīng)用于編織、制漿造紙和建筑材料等領(lǐng)域。然而，目前中國(guó)的竹纖維制品多是低附加值的產(chǎn)品，研究和開(kāi)發(fā)高附加值的竹纖維產(chǎn)品是充分利用中國(guó)竹資源的途徑之一。

隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，微晶纖維素作為一種可再生、可生物降解并具有良好機(jī)械性能的生物基材料，在食品、醫(yī)藥、日用化工等方面得到了廣泛的應(yīng)用。目前，從天然纖維素材料中分離制備微晶纖維素的方法主要有化學(xué)法和機(jī)械法［3］。化學(xué)法是利用酸對(duì)原料中的非纖維素組分以及非晶纖維素部分進(jìn)行水解，需要使用大量腐蝕性試劑，并且對(duì)環(huán)境造成污染，而機(jī)械法則需要消耗大量的能源，并且難以控制纖維的降解程度。因此，研究環(huán)保、低能耗的制備微晶纖維素的方法具有重要的意義。

與傳統(tǒng)的酸水解法相比，使用生物酶對(duì)纖維素進(jìn)行水解，反應(yīng)條件溫和，能耗小，且綠色環(huán)保。有文獻(xiàn)［4］報(bào)道，相比酸水解法，酶水解法能夠?qū)ξ⒕Юw維素的形貌進(jìn)行更好地控制。近年來(lái)，有研究者使用酶水解法與機(jī)械處理相結(jié)合，成功制備了尺寸更小的納米纖維素［1，5］。

本文研究的主要內(nèi)容是使用機(jī)械勻漿與酶水解相結(jié)合的方法，對(duì)竹纖維進(jìn)行處理，考察酶的種類(lèi)與用量對(duì)產(chǎn)物性狀的影響，探索綠色低耗的制備竹基微晶纖維素的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

竹漿纖維購(gòu)自貴州赤天化紙業(yè)股份有限公司。半纖維素酶購(gòu)自江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司，酶活性≥200 units·mg-1。纖維素酶購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，酶活性≥30 units·mg-1。檸檬酸和檸檬酸鈉為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 竹纖維的機(jī)械預(yù)處理

使用粉碎機(jī)對(duì)竹漿纖維進(jìn)行粉碎，并用40目篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)篩處理。將過(guò)篩后的竹漿纖維與去離子水按照1∶100的質(zhì)量比配制成混合溶液，使用均漿機(jī)對(duì)混合溶液進(jìn)行勻漿處理，勻漿轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速為13 Kr·min-1，勻漿處理20 min。

1.3 竹纖維的酶水解

使用半纖維素酶或半纖維素酶與纖維素酶的復(fù)合酶對(duì)勻漿處理后的竹纖維進(jìn)行酶水解。使用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值為4.8，反應(yīng)溫度為45～50℃，反應(yīng)時(shí)間為48 h。反應(yīng)結(jié)束后，加熱反應(yīng)溶液至90℃以上使酶失活。將產(chǎn)物反復(fù)水洗至中性，高速離心得固體樣品，于105℃干燥至恒重。酶水解中半纖維素酶的用量為竹纖維干重的30%，纖維素酶的用量分別為竹纖維干重的0%、1.5%和15%，樣品編號(hào)依次為BF-30/0、BF-30/1.5和BF-30/15。

1.4 產(chǎn)物性能測(cè)試

使用JSM-6390型掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)產(chǎn)物的微觀形貌進(jìn)行表征。使用X-pertPro型X射線衍射儀（XRD）對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行表征，Cu靶，Cu-Kα輻射，電壓為40 KV，測(cè)試范圍為2θ=5～50°。使用STA 449 F3型同步熱分析儀對(duì)纖維的熱穩(wěn)定性進(jìn)行表征，氣氛為氮?dú)?，升溫速率?0 K·min-1。使用Impact410型傅里葉紅外光譜儀（FTIR）對(duì)產(chǎn)物的紅外光譜進(jìn)行測(cè)量，掃描范圍為400～4 000 cm-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 機(jī)械處理與酶水解對(duì)竹纖維形貌的影響

圖1為勻漿前后竹纖維的SEM圖。圖1a為勻漿之前的竹纖維原樣，可以看出竹纖維結(jié)構(gòu)完整，呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)型，寬度大約在10～30μm左右。從圖1b中可以看出竹纖維原樣為圓柱狀，表面不光滑，有較多的褶皺，這是制漿處理造成的。勻漿處理后的竹纖維的形貌如圖1c和1d所示。勻漿處理中，轉(zhuǎn)頭部位能夠產(chǎn)生強(qiáng)大的剪切力，竹纖維在強(qiáng)剪切力的作用下被截?cái)啵▓D1c），同時(shí)，在剪切力的作用下，纖維的表面結(jié)構(gòu)也受到了破壞，如圖1d所示，纖維的表層結(jié)構(gòu)被部分剝離，產(chǎn)生了薄膜狀或微纖狀的碎片。勻漿處理對(duì)纖維表層結(jié)構(gòu)的剝離有助于后續(xù)的酶水解反應(yīng)，表層結(jié)構(gòu)的剝離增加了酶水解的反應(yīng)面積，結(jié)構(gòu)的破壞有利于增加酶解可及度。

圖1 機(jī)械勻漿處理前后竹纖維的SEM圖（a）、（b）竹纖維原樣 ；（c）、（d）勻漿處理后的竹纖維Fig.1 SEM images of bamboo fibers before and after homogenization（a，b）Original bamboo fibers；（c，d）Homogenized bamboo fibers.

圖2 是使用不同種類(lèi)和不同用量的酶水解后的纖維的SEM圖。由圖2a和2b中可以看出，使用30wt%半纖維素酶水解后，竹纖維發(fā)生了大量的橫向斷裂，由原來(lái)的細(xì)長(zhǎng)型結(jié)構(gòu)變成的短棒狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)，纖維的寬度減小至15～5μm左右。當(dāng)使用半纖維素酶與纖維素酶的復(fù)合酶進(jìn)行水解時(shí)，纖維的橫向斷裂進(jìn)一步加劇，同時(shí)出現(xiàn)了少量的球狀微粒，微粒表面較為光滑，有少量孔洞，如圖2c和2d所示。隨著纖維素酶用量的增加，如圖2e和2f所示，短棒狀的纖維結(jié)構(gòu)基本消失，產(chǎn)物大部分為球狀微粒，微粒的直徑分布較為均一，在10～15μm左右，且微粒表面出現(xiàn)大量的孔洞結(jié)構(gòu)。半纖維素酶對(duì)竹纖維結(jié)構(gòu)中的半纖維素組分的水解造成了纖維的橫向斷裂以及纖維寬度的減小，纖維素酶對(duì)半纖維素酶的水解具有一定的協(xié)同作用，加劇了纖維的橫向斷裂，并最終生成微球結(jié)構(gòu)，而微球結(jié)構(gòu)表面的孔洞則是由纖維素酶對(duì)纖維素的非晶部分進(jìn)行水解造成的。

圖2 酶水解后竹纖維的SEM圖（a）（b）BF-30/0；（c）（d）BF-30/1.5；（e）（f）BF-30/15Fig.2 SEM images of enzyme hydrolyzed bamboo fibers（a，b）BF-30/0；（c，d）BF-30/1.5；（e，f）BF-30/15.

2.2 竹纖維FTIR譜圖分析

圖3 為酶水解前后竹纖維的FTIR譜圖。所有樣品在3 400 cm-1附近都出現(xiàn)了寬而強(qiáng)的吸收峰，這是纖維中大量存在的羥基O-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，并由于氫鍵的形成而產(chǎn)生了寬峰。在2 900 cm-1附近所有樣品都出現(xiàn)了中等強(qiáng)度的尖峰，這是C-H伸縮振動(dòng)吸收峰。在1 650 cm-1附近所有樣品都出現(xiàn)了中等強(qiáng)度的吸收峰，這是樣品中吸附水的H-O-H彎曲振動(dòng)吸收［6］，并且酶水解后的樣品在該處的吸收峰變強(qiáng)變寬，說(shuō)明酶水解后竹纖維對(duì)水的吸附能力更強(qiáng)。在1 025 cm-1附近，所有樣品都呈現(xiàn)多重吸收峰，這是C-O伸縮振動(dòng)的吸收峰。同時(shí)，從圖3中可以發(fā)現(xiàn)，竹纖維原樣在1 410 cm-1處有吸收峰，對(duì)應(yīng)于纖維素結(jié)構(gòu)中C6位CH2的剪式振動(dòng)［7］，而經(jīng)過(guò)酶水解后的纖維樣品在此處沒(méi)有明顯的吸收，表明酶對(duì)纖維素的分子鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行了降解。

2.3 酶水解對(duì)竹纖維結(jié)晶度的影響

圖4是酶水解前后竹纖維的X射線衍射圖譜。從圖中可以看出，所有的樣品在2θ為15°、16°、22.5°和34.5°附近有衍射峰，分別對(duì)應(yīng)天然纖維素I型晶胞的（101）、（10 1）、（002）和（040）衍射面［8-10］。其中，2θ為15°和16°的2個(gè)衍射峰合并為1個(gè)較寬的峰，這說(shuō)明樣品中含有非晶組分，如半纖維素、非晶纖維素等。同時(shí)，當(dāng)增加了纖維素酶后，在2θ等于20°附近出現(xiàn)了明顯的肩峰，這是纖維素II型晶胞的（10 1）面的衍射峰［10］，說(shuō)明隨著酶水解程度的增大，部分纖維素I型結(jié)晶向纖維素II型結(jié)晶進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。

使用 Segal［11］方法計(jì)算各樣品的結(jié)晶指數(shù)（CI），如下式所示：

圖3 竹纖維酶水解前后的FTIR譜圖（a）竹纖維原樣；（b）BF-30/0；（c）BF-30/1.5；（d）BF-30/15Fig.3 FTIR spectra of bamboo fibers before and after enzymatic hydrolysis（a）Original bamboo fibers；（b）BF-30/0；（c）BF-30/1.5；（d）BF-30/15.

其中，I002是（002）衍射峰的最大強(qiáng)度，Iamorphous是非晶區(qū)的衍射強(qiáng)度，取值為（002）和（101）衍射峰之間的峰谷（2θ≈18.5°）的強(qiáng)度。

結(jié)晶指數(shù)的計(jì)算結(jié)果標(biāo)注在圖4中，可以看出，使用30wt%的半纖維素酶對(duì)竹纖維進(jìn)行水解后，樣品的結(jié)晶指數(shù)有所上升，這是由于半纖維素酶對(duì)竹纖維中非晶的半纖維素組分進(jìn)行了降解，從而減少了樣品中的無(wú)定型部分。同時(shí)，纖維素酶的加入導(dǎo)致了樣品結(jié)晶指數(shù)的降低，這是由于纖維素酶優(yōu)先對(duì)纖維素非晶部分進(jìn)行了水解，從而使暴露出來(lái)的結(jié)晶部分向非晶進(jìn)行轉(zhuǎn)變，另一方面，纖維素酶可能對(duì)結(jié)晶較不完善的部分也有水解作用，這也會(huì)使得產(chǎn)物的結(jié)晶度下降。

2.4 酶水解對(duì)竹纖維熱穩(wěn)定性的影響

圖5和圖6分別為酶水解前后竹纖維的熱失重（TG）曲線和DTG曲線。根據(jù)文獻(xiàn)［12-13］報(bào)道，半纖維的主要熱失重范圍為220～300℃，熱分解峰值溫度在268℃左右，纖維素的主要熱失重范圍為300～400℃，熱分解峰值溫度在355℃左右。與纖維素相比，半纖維分子量的支化程度高，聚合度低，從而導(dǎo)致其熱穩(wěn)定性低于纖維素的熱穩(wěn)定性［13］。從圖5和圖6中可以看出，竹纖維原樣只呈現(xiàn)一個(gè)熱失重峰，峰值溫度為355℃，為纖維素的熱失重。同時(shí)，在半纖維素的熱失重溫度范圍內(nèi)未出現(xiàn)明顯的肩峰，說(shuō)明制漿過(guò)程已將樣品中大部分的半纖維素除去。BF-30/0試樣也只呈現(xiàn)一個(gè)熱失重峰，峰值溫度為344℃，為纖維素的熱失重。相比原樣，其熱失重峰向低溫方向移動(dòng)，一方面是由于半纖維素酶對(duì)樣品中殘留的半纖維素組分進(jìn)行了降解，使其熱穩(wěn)定性能降低，另一方面，由于酶水解對(duì)纖維的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了破壞（如圖2a和2b所示），使得纖維熱穩(wěn)定性能下降。

當(dāng)使用了纖維素酶后，樣品BF-30/1.5和BF-30/15的熱失重曲線上都出現(xiàn)了除主要熱失重峰以外的明顯肩峰。BF-30/1.5的熱失重峰值溫度為354℃，同時(shí)，在310℃附近有明顯的肩峰。這是由于纖維素酶優(yōu)先對(duì)纖維素的非晶部分進(jìn)行了水解，使得纖維素的分子鏈發(fā)生斷裂，從而在較低溫度出現(xiàn)了明顯的熱降解，同時(shí)在較高溫度的熱失重為結(jié)晶度較高的纖維素組分的熱分解。BF-30/15的熱失重峰值溫度為300℃，同時(shí)在335℃附近出現(xiàn)明顯的肩峰，隨著纖維素酶用量的增加，纖維素組分的水解程度加劇，從而使其熱穩(wěn)定性能進(jìn)一步降低，熱失重溫度向低溫方向移動(dòng)。

圖4 竹纖維酶水解前后的XRD譜圖Fig.4 X-ray diffraction patterns of bamboo fibers before and after enzymatic hydrolysis

圖5 竹漿纖維酶水解前后的熱失重曲線圖Fig.5 TG curves of bamboo fibers before and after enzymatic hydrolysis

圖6 竹漿纖維酶水解前后的DTG曲線圖Fig.6 DTG curves of bamboo fibers before and after enzymatic hydrolysis

3 結(jié)論

機(jī)械勻漿預(yù)處理能夠破壞竹纖維的表面結(jié)構(gòu)，增加酶解反應(yīng)的可及度。用半纖維素酶和纖維素酶同時(shí)進(jìn)行水解時(shí)，得到了粒徑在10～15μm左右的纖維素球狀微粒。用半纖維素酶單獨(dú)進(jìn)行水解時(shí)，竹纖維的結(jié)晶度略有提高，而其與纖維素酶同時(shí)水解后，樣品的結(jié)晶度降低，同時(shí)產(chǎn)生了纖維素I型結(jié)晶向纖維素II型結(jié)晶的轉(zhuǎn)化。酶水解后，由于纖維結(jié)構(gòu)的破壞以及纖維素分子鏈的斷裂，竹纖維的熱穩(wěn)定性降低。與傳統(tǒng)的微晶纖維素的制備方法相比，研究所采用的機(jī)械輔助酶水解法具有環(huán)保和低能耗的優(yōu)點(diǎn)，在開(kāi)發(fā)和利用纖維素材料方面具有一定的應(yīng)用前景。